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【摘要】目的 建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR法检测单个细胞地贫基因突变的技术方法。方法 分离已知基因型的外周血标本单个淋巴细胞，用巢式PCR外引物进行第一轮扩增，第二轮用TaqMan探针进行相应基因型的实时PCR检测，其中不同荧光报告基团标记的探针分别与正常、异常等位基因特异杂交，结合各荧光的终点变化及其实时动力学曲线判断对应等位基因存在与否。SEA缺失型α地贫基因用常规TaqMan探针实时PCR检测，β地贫基因用TaqMan-小沟结合物（minor groove binder, MGB）探针实时PCR检测。结果 对3种地贫基因突变的不同基因型标本分别进行了单细胞检测试验，各种基因型均可通过结合相应荧光的终点变化及其实时动力学曲线进行判断。单细胞扩增效率均在95%以上，杂合子的等位基因扩增丢失（allele dropout, ADO）率在3.3% ~ 8.1%之间，假阳性率在5%以下。结论 基于TaqMan探针的实时荧光PCR能够快速、特异、准确地检测单个细胞标本的相应地贫基因型。



【关键词】实时荧光PCR；地中海贫血；单个细胞







胚胎植入前遗传诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）[1-4]和用母体血中富集的胎儿有核红细胞进行产前诊断均对单细胞分子诊断技术有较高要求，发展单细胞PCR技术平台是必不可少的环节。单细胞PCR过程中应尽可能地控制污染，而基于TaqMan探针的实时荧光PCR是在反应体系完全封闭的情况下实时检测PCR扩增动力学变化，能有效防污染，且具快速、特异性高的优势[5，6]。TaqMan-MGB探针实时荧光PCR可有效用于检测基因的点突变[7]。α地贫SEA缺失型和β地贫CDs 41/42 (-CTTT) 和IVS-2 nt 654 ( C→T )突变型是我国南方分布最广、危害最大的单基因遗传病分子基础[8]。我们拟建立针对上述3种致病突变的基于TaqMan探针的实时荧光PCR技术检测平台，以达到能对单个细胞模板的地贫基因突变进行分子检测的目的。







1 材料和方法







1．1 材料



1．1．1 标本 地贫外周血标本来源于我中心、中山大学中山医学院医学遗传学教研室、中山大学附一院生殖医学中心等。SEA缺失型α地贫携带者经3套不同位点引物的PCR检测系统和部分标本测序验证；CDs 41-42 (-CTTT)和IVS-2 nt 654(C→T)型β 地贫标本经反向斑点杂交（reverse dot blot, RDB）和DNA测序验证。







1．1．2 引物 检测SEA缺失型α地贫基因的Gap-PCR内外引物由美国Integrated DNA Technology公司合成，外引物序列为：5′-TTTTGAGACGATGCTTGCTTTGTCAC -3′；5′-GATCTGGGCTCTGTGTTCTCAGTATTGG–3′；5′-GCTGAGGTGGGAAGACTGCTTGAG–3′；内引物序列为：5′-CCTGAGCAACATAGTGAGACCTGT–3′；5′-GAAGCTGAGTGATGGGTCCG–3′；5′-GCTTACTGCAGCCTTGAACTCC–3′。CDs 41-42 (-CTTT)和IVS-2 nt 654(C→T)型β 地贫基因突变内外引物由上海博亚公司合成，外引物序列为：5′-GGtacGGctGtcatcacttaGacctca-3′；5′-caGcttGtcacaGTGCAGctcact-3′；5′-CACATATTGACCAAATCAGGGTAATTTTGC-3′；5′-ccaGcacacaGaccaGcacGtt-3′；内引物序列为：5′–TCATGCCTCTTTGCACCATT–3′；5′–GATTGTAGCTGCTATTAGCAATATGAAAC–3′；5′–CACTGACTCTCTCTGCCTATTGGT–3′；5′–ACAGCATCAGGAGTGGACAGAT–3′。







1．1．3 TaqMan探针和TaqMan-MGB探针 检测α地贫SEA缺失型等位基因和正常等位基因的TaqMan探针由美国Integrated DNA Technology公司合成，序列如下：5′FAM- AGTGAACCCCAGGCCGCGAC–TAMRA -3′ ；5′TET- CAAGTGTGGTAGTGCACACCTATGTCCCA-TAMRA- 3′。 β 地贫CDs 41-42(-CTTT)和IVS-2 nt 654(C→T)型等位基因和正常等位基因的TaqMan-MGB探针由上海基康公司合成，序列如下： 5′-FAM-AAGGACTCAAAGAACC-MGB-3′；5′-VIC-AAGGACTCAACCTCT–MGB-3′；5′-FAM-TTGCTATTGCCTTAAC-MGB-3′；5′-VIC-ATTGCTATTACCTTAACC-MGB-3′。







1．2 方法



1.2.1 单个细胞PCR模板制备 待检2ml EDTA抗凝外周血用淋巴细胞分离液（上海恒信化学试剂公司）两次离心分离得到淋巴细胞富集层，用含1g/100ml BSA（Sigma公司）的DPBS缓冲液（Sigma公司）洗涤、稀释至1～5个单个核细胞/5μl，倒置显微镜下,用嘴控制的毛细玻璃管吸取1个单个核细胞（空白对照只吸细胞旁的液体）于备有5μl碱裂解液（200 mmol/L KOH, 10 mmol/L DTT, Sigma）的200 μl PCR反应管中，95℃变性5分钟后保存于－20℃备用。







1.2.2 巢式PCR外引物第一轮扩增 各反应管中先加入5 μl酸中和液（20 mmol/L Tris HCl，pH 8.3，200 mmol/L HCl），加入含相应引物的PCR反应混合液38 μl混匀后[混匀后含50 mmol/L KCl, 8 mmol/L Tris HCl, pH 8.3, 1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，500 nmol/L各种引物，1.25单位AmpGold Taq酶 (AppliedBiosystems公司)]，进行两步PCR反应，PCR反应条件为：95℃热启动10 min，95℃变性25 s，63℃退火延伸45 s，共20个循环。







1.2.3 使用TaqMan和TaqMan-MGB探针进行第二轮实时荧光PCR检测 选用透光反应管（AppliedBiosystems公司）在ABI 7700 Sequence Detector仪器上中进行PCR反应，50 μl反应体系中，含有45 μl TaqMan core reagent反应试剂（AppliedBiosystems公司）和相应200 nmol/L的各种引物和探针，以5μl第一轮单细胞模板扩增产物作为PCR扩增模板，PCR反应条件为：95℃热启动10 min.，95℃变性15 s，60℃退火延伸45 s，共40个循环。







2 结果







2．1 终点读板法检测地贫基因突变 第二轮TaqMan探针实时荧光PCR反应完毕后，利用ABI 7700 Sequence Detector仪器配套分析软件的allele discrimination 功能对所标记荧光信号的变化进行终点法分析，分析软件自动显示各反应孔基因型（图1）。但是，此高通量自动分析法不能保证对每一反应孔都作出相应基因型的判断。

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图1 珠蛋白基因缺陷读板检测结果



兰色圆点代表纯合正常基因型，红色圆点代表纯合异常等位基因型，绿色圆点代表杂合基因型，黑色方块代表反应管无扩增，叉表示基因型无法确定

2．2 实时荧光PCR法判断标准 利用相对应荧光信号的终点变化及其实时动力学曲线判断它们分别代表的等位基因存在与否，具体原则为：TaqMan-MGB探针与特异等位基因杂交产生的终点荧光变化值较同一探针与非特异等位基因交叉反应的终点荧光变化值高出3倍以上；同时，TaqMan-MGB探针与特异等位基因杂交的PCR实时动力学曲线呈平稳的S形曲线。图2为β地贫IVS-2 nt 654 ( C→T )突变的3种基因型（正常型、杂合型、异常纯合型）的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR动力学曲线检测模式。



图2 β地贫IVS-2 nt 654 ( C→T )突变3种基因型的实时荧光PCR动力学曲线模式图（纵坐标ΔR为标记荧光变化值，横坐标为循环周期数）



左边3面版示FAM荧光信号,代表正常等位基因；右边3面版示VIC荧光信号，代表突变等位基因。上方两面版示正常等位基因纯合子PCR扩增动力学曲线模式图；中间两面版示杂合子PCR扩增动力学曲线模式图；下方两面版示突变等位基因纯合子PCR扩增动力学曲线模式图。

2．3 巢式实时荧光PCR法检测单细胞地贫基因突变 使用实时荧光PCR法判断标准对单个细胞和空白对照突变基因进行检测，部分样本检测结果见图3，检测结果汇总统计见表1。





图3 部分地贫临床标本实时扩增反应动力学曲线



a:正常等位基因检测结果；b:异常等位基因检测结果

3 讨论



单细胞检测是PGD的基础，单卵裂球检测之前用于反应体系优化的单细胞模板一般来自淋巴细胞、卵裂球等。鉴于卵裂球不易获取，我们选用较为方便的新鲜制备的外周血单个淋巴细胞作为PCR扩增模板建立单细胞PCR体系。



单细胞所含DNA量极其有限，为保证DNA抽提质量、避免丢失，通常用于抽提的试剂将作为下一步PCR检测体系的一部分，这就要求保障获取高质量DNA模板的同时，必须兼顾不对PCR反应体系产生影响，这是PGD的成功保证。目前，多种裂解单细胞的实验方法都在常规使用，包括纯水法、冻融法、碱法和蛋白酶K法等。我们选用碱法作为单细胞提取方法，主要考虑碱法所带来的相对较高的扩增率和较低的等位基因丢失（allele dropout, ADO），这可能是因为碱性溶液可以使DNA变性，增加了可用于扩增的单链模板数；同时，碱性溶液还可以水化RNA，二硫苏糖醇（DTT）可以打断二硫键，使染色体DNA结合的蛋白质从DNA上释放出来，导致更多的DNA与引物结合，提高扩增效率，减少ADO的发生[9]。本实验的扩增效率达到95%以上，而等位基因缺失率只有6.5%～9.1%，这个比较满意的结果也得益于碱法的选取。



基于荧光探针的实时PCR反应最初主要用于定量测定PCR反应起始模板拷贝数[10]，由于该技术优势明显，我们尝试将其用于单细胞模板的地贫突变基因型检测。由于反应体系是在完全封闭的情况下实时检测PCR扩增动力学变化，能有效防止污染：可能产生大量PCR产物污染源的第二轮PCR执行了闭管检测，无需开放式操作；而第一轮PCR由于循环数少、起始模板数低，产物污染的可能性大大降低。实时荧光PCR体系检测的是探针杂交信号，这一巢式引物加探针的检测体系特异性更高。所有检测数据计算机自动分析，能够同时完成PCR扩增和探针杂交检测。而且，整个标本处理、检测过程5～6小时内可以完成，较常规PCR产物凝胶电泳分析、RDB点突变检测等技术更为快速。实验结果来自实时荧光PCR反应过程动态曲线，较一般终点分析法的信息量更大、更可靠。



TaqMan- MGB探针实时PCR可有效用于检测点突变。MGB是源于某些抗生素分子的化学基团，能嵌入DNA双螺旋的小沟形成非共价结合[11]，有效提高带有MGB基团的寡聚核苷酸探针的退火温度，比相同Tm值的普通寡聚核苷酸探针较少核苷酸单体，从而使单个碱基突变更敏感地干扰不匹配的探针与等位基因间的退火，更有效地检测出匹配的探针与等位基因间的结合[12-16]。有研究报道[17]，结合了MGB的12个单体探针与未结合MGB的27个单体探针具有相同的Tm值。这类MGB基团结合到TaqMan荧光探针3′端，可用于检测常规TaqMan荧光探针难以区分的单碱基突变等位基因。



适应于等位基因的检测分析，PE公司配套推出了等位基因分析软件，根据两条探针各自的最终的荧光增加值，即终点法以对检测结果进行判断。PCR结束后，使用96孔板读取装置检测分析每个反应管的VIC和FAM荧光值，再通过相关软件（WPR version 3.0, Perkin Elmer Instruments）对所收集数据加以整理分析。反应中设立8个空白对照，从所有样品管中剔除空白对照的平均荧光值进行标准化；同时，空白对照的平均荧光值也用于确定标准差（SD）。对基因型进行的自动分析中，以空白对照平均荧光值的两倍标准差（2×SD）作为域值：如果标准化荧光值大于2×SD，则认为该等位基因存在；否则，认为等位基因不存在。



为了保证每一检测孔结果的可靠性，我们首次确立了等位基因实时荧光PCR法同时分析其相应的实时PCR动力学曲线，更为直接地观察到相应等位基因有无扩增，也就是结果中所示的3种突变基因型的实时荧光PCR动力学曲线走向和荧光强度值ΔR的模式图。



我们建立荧光探针实时PCR检测单个细胞地贫基因的技术平台旨在常规进行胚胎植入前遗传学诊断，其优势主要表现在如下两方面：第一，快速。PGD要求卵裂球活检后数小时内完成相应胚胎的基因型判断，方能保证体外发育的胚胎在卵裂球期移植回母体子宫内，提高胚胎着床、妊娠可能性[18，19]。第二，有效防污染。PGD要求单细胞PCR时应严格控制污染，以防误判基因型。单细胞PCR要面临等位基因扩增丢失现象，也就是在扩增起初的几个循环时，可能由于两个等位基因的其中一个得到优势扩增而最终导致其完全覆盖另一等位基因，使得该等位基因无法检出，或是由于单细胞模板中某等位基因的1~2个拷贝本身受损所致[20]，本检测体系针对的地中海贫血为隐性遗传病，如果选择必须有正常等位基因的胚胎移植回母体子宫内，即使发生ADO也不会导致严重后果。



相对于传统检测方法，等位基因特异荧光探针的使用不仅将检测灵敏性提高了近1 000倍，而且也有助于减少污染的可能[19]。通过对大量单个细胞的检测，我们建立的单细胞巢式荧光探针实时PCR技术平台能够达到对单个细胞模板的地贫基因进行分子检测的目的。







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