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第一节 概述

现代医学是随着自然科学各基础学科的发展而发展。在临床观察的基础上，其检验、诊断、治疗和病理生理学的进展是与实验研究方法的创新与改进分不开的。分子生物学的迅速发展，全面地渗透到医学科学各个领域中，揭示了许多新现象，提出了不少新问题，是医学向分子水平迈进的一个重要依据和手段。使医学科学达到了一个新的阶段，医学分子生物学已逐渐形成了比较完整的理论体系。医学检验与诊断学也不例外，分子生物学技术在医学检验诊断中的广泛应用，逐步形成诊断分子生物学（diagnostic molecular biology）这一学科分支。诊断分子生物学的内容主要包括：

⒈内源基因异常的检验与诊断 在分子水平为疾病的发生机制，治疗和预后提供实验依据。自身基因结构异常导致基因功能异常而致病，或使其表达产物蛋白质的结构与功能异常而致病，或使基因调控失常而致病，如遗传性疾病、肿瘤等。

⒉外源基因侵入体内的检验与诊断 对多种病源微生物（如细菌、病毒、衣原体、支原体等）的检出，可望实现快速、灵敏、准确。在分子水平可更准确地分类亚种和变种。探明病源微生物致病的机制。

生物大分子指核酸和蛋白质分子，是生命物质的基本要素，如最简单的生命体病毒、噬菌体仅以核酸，蛋白质为主，却表现了生命的最基本的功能。核酸的表达产物是蛋白质，为因果关系。核酸是生命的存在形式，蛋白质是生命的表现形式。许多疾病的临床表现与某些蛋白质的结构和功能异常有关，但究其原因可能是基因的结构和功能异常导致基因表达产物蛋白质异常所为。

蛋白质结构与功能的检验和临床诊断应用方法已日趋完善，而核酸结构与功能的研究历史短，研究前景广，是目前分子生物学研究的主要内容。特别是在临床检验、诊断、预后、治疗方面的开发前景受到医学工作者关注。

核酸（nucleic acid）具有储存和表达遗传信息的功能，前者为脱氧核糖核酸（deoxyri-bonucleic acid，DNA）承担，后者由核糖核酸（ribonucleic acid，RAN）参与。碱基（base）、脱氧核糖（deoxyribose）或核糖（ribose）、磷酸（phosphate）三种分子组成核苷酸（nucleotide），核苷酸之间以磷酸二酯键在纵向按一定的排列顺序组成核酸的一级结构，是链状结构。在此基础上形成二级或更高级的空间结构，方能显示其生物功能。

组成DNA的碱基有腺嘌呤（adenine A）、鸟嘌呤（guanine G）、胞嘧啶（cytosine C）和胸腺嘧啶（thymine T），RNA的碱基为A、G、C和尿嘧啶（uracil U）。碱基在紫外光260nm波长附近有较强吸收峰，该特性常用于核酸分析。碱基（嘌呤环的N-9或嘧啶环的N-1）与核糖（C-1′）以糖苷键结合形成核苷，核苷（C-5′）与磷酸以磷酸酯键结合形成核苷酸。核苷可与1-3个磷酸结合，如腺苷与一个磷酸结合为腺苷酸（AMP），与二个磷酸结合为二磷酸腺苷（ADP），与三个磷酸结合为三磷酸腺苷（ATP）。第一个核苷酸的C-3′位羟基与第二个核苷酸的C-5′位磷酸以磷酸二酯键结合，以此类推成百上万的核苷酸结合可形成一条大分子核酸单链，单链之间的碱基再以氢键结合可形成较稳定的核酸大分子双链结构（二级结构）。

核酸的简写方式为5′AGCTGTAC3′，此外的英语字母已不代表碱基，而是指核苷酸。核酸的书写方向与合成方向一致，都是5′→3′。习惯上碱基原子次序不用‘′’而核糖环原子标以‘′’，故5′表示核糖的C-5，并与磷酸基团连接，3′为核糖的C-3，并带有－OH基团。可写作5′pAGCTGTAC－OH3′。

核酸的高级结构以1953年Watson和Crick发表的DNA双螺旋结构最著名。DNA分子由两条核苷酸组成的单链，按右手螺旋盘旋，两条单链走向相反。两条单链之间的横向碱基A＝T以二个氢键配对，G≡C以三个氢键配对，使DNA分子的双链之间有严格准确的碱基配对关系，形成DNA二级结构。在此基础上可形成超螺旋，即三级结构。

DNA分子的一个重要物理性质是在过酸、过碱或加热的溶液中，双链间的氢键可分开成单链，称为变性。变性是可逆的，改变条件，解开的单链可重新按碱基配对规则，A＝T、G≡C严格配对形成双链，形成的双链与变性前的结构完全相同，称为复性。解链的DNA溶液在260nm处吸光值A₂₆₀增大，即核苷酸＞单链DNA＞双链DNA，称为高色效应，反之为低色效应。以50μg/ml为例，A₂₆₀分别为：双链DNA＝1.00，单链DNA＝1.34自由碱基＝1.60；或A₂₆₀＝1.00时双链DNA＝50μg/ml，单链DNA＝37μg/ml，mRNA＝40μg/ml。一般同时在A₂₈₀测定蛋白质含量，纯化的DNa A₂₆₀/A₂₈₀≥1.8；纯化的mRNa A₂₆₀/A₂₈₀≥2.0，即蛋白质含量少。实验室常用加热使DNA变性，因为G≡C之间有三个氢键，而A＝T之间只有二个氢键，解链温度取决于DNA分子中G≡C配对多少。以加热温度对A₂₆₀作图可以得到一条解链曲线，解链开始到完全解链的温度范围的中点温度称为解链温度（meltingtemperature，Tm）又称熔链温度。Tm值大小与DNA的G＋C含量百分数成正比。虽有推算Tm值的经验公式Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)，但只能用于20个核苷酸以下的DNA小分子。而且实验条件可影响Tm。如三氯醋酸钠存在使Tm变小，氯化钠存在可使Tm升高。变性的DNA溶液经处理后，使单链的碱基重新配对形成双链的过程叫复性或退火。同源DNA复性叫复性DNA，不同源DNA复性的过程叫核酸杂交，形成的双链叫杂化双链。杂交可以发生在DNA分子之间，也可以发生在DNA与RNA分子之间，如DNA-DNA′；DNA-mRNA。影响复性的因素很多，如离子强度、温度、DNA浓度和长度等，一般采用0.15-0.5mol/l NaCl；温度低于Tm20-25℃，过高不利于复性，过低易发生单链内碱基随机配对或非特异性结合。复性的开始是碰撞，因此DNA浓度高时，碰撞机会多，复性速度快。

DNA的生物功能是携带、传递和表达遗传信息。基因是DNA大分子中一段有生物功能的片段。即在自然界可表达一分子具有生物活性的肽链，也可携带和传递给子代表达相同的肽链的信息。基因组是所有基因的集合。

DNA碱基严格的配对，稳定的结构可将携带的遗传信息保留在生命体内。当细胞分裂时，DNA双螺旋结构解开分为两条单链，暴露碱基。在DNA合成酶作用下，两条链各自为模板（母链），按碱基配对原则合成与母链严格互补的互补链。子代细胞的DNA分子一条链来自亲代，一条是按碱基配对原则合成的新链，这一过程为复制，这种复制的方式称为半保留复制。半保留复制使子代与亲代的DNA分子双链碱基序列完全一致。遗传信息就这样准确地传递给子代。复制过程以母链为模板，游离的脱氧三磷酸核苷为合成新链的原料，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，总称dNTP。催化新链合成反应的酶是以DNA为模板的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase）。DNA聚合酶需要一段寡核苷酸作为引物（primer）引导，以母链为模板，按碱基配对原则，将dNTP逐个由5′→3′方向合成新链，合成的新链走向5′→3′与母链3′→5′走向相反。1958年首先在大肠埃希菌发现DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），继而发现原核生物有DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。聚合酶Ⅲ主要功能是复制，聚合酶Ⅰ的主要功能是在DNA碱基配对发生错误或DNA损伤时起修复作用，聚合酶Ⅱ的功能尚不清楚。三种聚合酶均有从5′向3′或3′向5′逐一把核苷酸从核酸链上水解下来的核酸外切酶（exonuclease）作用。聚合酶Ⅰ外切酶活性最强，便于切除错误和修复。用枯草菌溶素（蛋白酶）水解聚合酶Ⅰ后产生大、小片段，其中大自然切去了3′→5′的外切酶活性，保留5′→3′方向的聚合酶和外切酶活性，称为Klenow片段（Klenow fragment），是分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA的另一个生物功能是通过转录和翻译，将遗传信息表达为具有生物功能的产物-基因产物，如肽链、酶、蛋白质等。使遗传得到表达，生命得以表现。

RNA有信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，结构相对简单，生物功能主要转录DNA的遗传信息，翻译DNA的遗传信息，表达DNA的遗传信息。

合成RNA的过程为转录。转录酶是依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）。转录与复制有相似之外，均需依赖DNA的聚合酶，都以DNA为模板；均需核苷酸作原料，都为5′向3′延长；且均遵从碱基配对原则。但也有明显的不同之处，复制是把作为模板的DNA两条母链均复制，而转录只转录DNA双链中的有意义链；合成原料前者利用脱氧核苷酸mRNA、tRNA、rRNA三种RNA，且RNA中无胸腺嘧啶T，而以尿嘧啶U代替T，碱基配对也由A＝T转为A＝U；参与复制的DNA聚合酶需引物，而用于转录的RNA聚合酶无需引物，自身有识别转录起点的功能。与复制不同的是转录只需以一条DNA链为模板，因此把可作为转录模板的一条DNA链称为有意义链（sense strand or Watson strand），与此对应的一条不参与转录的链称为反意义链（antisense strand or Crick strand）。有意义链并不固定在DNA双链的某一条链上，而是在两条链上交替出现，使转录也是交替进行，这一现象称为不对称转录。转录的重要产物是mRNA，因为mRNA可作为肽链合成的模板，指导蛋白质合成。由此把可转录产生mRNA并指导蛋白质合成的一段DNA称为结构基因（structural gene），其余的DNA可转录tRNA和rRNA，还有许多起调节作用的调节基因，但有相当一部分的DNA功能尚不清楚，既不承担转录功能也无调节作用。真核生物的基因往往是一种断裂基因（splite gene）即一个结构基因，一条有意义链中的DNA碱基序列并不都能表达为蛋白质。可表达为蛋白质的区域称编码区，反之为非编码区，编码区与非编码区在基因中相间排列。1978年，Gilbert把可编码蛋白质的DNA序列称外显子（exon），把非编码称内含子（intron）。真核细胞刚完成转录的mRNA含外显子和内含子，称杂化核RNA（heteroge-neous nuclear RNA，hnRNA），这种初级mRNA的分子量往往比成熟的mRNA大几倍。hnRNA在细胞核内经剪接加工，切去内含子，并在5′端加上7-甲基鸟嘌呤和三磷酸鸟苷的帽子结构（cap structure）在3′端加上多聚脱氧腺苷酸（poly A）后，进入细胞质为成熟的mRNA。

基因表达在复制、转录、翻译水平及各水平表达后加工均可进行调控。目前对原核生物的转录水平调控研究较多，较为清楚。原核生物中，功能相关的几个结构基因往往排列在一起，转录出一段较长的mRNA，称为多顺反之（polycistron），并指导合成（翻译）一套功能相关的蛋白质。这样的一组基因及调节部分称为操纵子（operon）。乳糖操纵子（Lac operon）就是由调控区的启动子（promoter，p）、操纵区（operator，o）和表达β-半乳糖苷酶（Z）、β-半乳糖苷透性酶（Y）、β-半乳糖苷乙酰转移酶（a）三种功能相关酶的相关基因组成。乳糖操纵子是可诱导的负调控型操纵子，在高效诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，产生相应的酶并作用底物5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galac toside，x-gal）产生蓝色，在重组基因筛选中被广泛应用。有名的操纵子还有可诱导的正调控操纵子－阿拉伯糖操纵子（Ara operon），可阻遏操纵子－色氨酸操纵子（Trp operon）。可诱导指关闭的基因在诱导剂存在下可开启表达，可阻遏指开放的基因在阻遏物存在下可关闭表达。

由转录把DNA上基因的信息（脱氧核苷酸序列）变为mRNA核苷酸序列，生物体合成mRNA并把转录的信息（核苷酸序列）转变为蛋白质的氨基酸序列的过程称翻译。复制、转录在细胞核完成，翻译在细胞质进行。

翻译从mRNA5′开始，向3′方向每三个碱基为一个密码（codon），称三联体密码。4种碱基可组合64种密码，代表了20种氨基酸和翻译的起点与终止密码，如5′-CGUGG AUAA-3′代表精氨酸甘氨酸和终止密码。密码之间无标点符号，当多一个或少一个核苷酸时，可使密码重排列移码（frame shiff），由此引起的变异称移码突变。翻译过程中以mRNA为模板，rRNA为场所，tRNA搬运与密码对应的氨基酸，自mRNA5′端开始合成多肽链，多肽链合成从氨基（N）端开始，第一个氨基酸的羧基与第二个氨基酸的氨基形成肽键，在羧基（C）端结束。故肽链合成方向是N→C。经翻译后加工形成有活性的蛋白质。

1958年，Crick把复制、转录、翻译的基因表达（gene expression）过程总结为分子生物学的中心法则（central dogma）。以后在病毒学研究中发现了依赖RNA的DNA聚合酶能进行逆转录，即反转录酶（reverse transcriptase，逆转录酶），可以RNA为模板复制DNA，由此得到的DNA称cDNA（complementary DNA，互补DNA，反转录DNA）。后来还发现了RNA复制RNA，M₁₃噬菌体的DNA可以单链存在，有时DNA还能以三链、四链体形式存在，大大丰富了中心法则。

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第二节 分子生物学实验基础

分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。

外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。

一、基因工程的常用工具

（一）载体

载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。

质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完******露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap^r、抗四环素Tc^r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。

常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

（二）工具酶

工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。

酶	识别序列	切口
Alu Ⅰ	…AGCT…	…AG CT…	四核苷酸
	…TCGA…	…TC GA…	平端切口
Eco R1	…GAATTC…	…G AATTC…	六核苷酸
	…CTTAAG…	…CTTAA G…	粘端切口

连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg²⁺和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。

大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。

末端转移酶在Mg²⁺存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co²⁺存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。

碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DN****段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图18-1）。

图18-1 经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接

二、目 的 基 因

常把需研究的基因称为目的基因，需分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法得到。简短的目的基因可在了解一级结构或通过了解多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列基础上人工合成。但多数的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反转录DNA）得到。CDNA通过各种方式与载体连接，克隆可得到全长cDN****片段，用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。（图18-2）

图18-2 目的基因cDNA的合成

三、基因库的建立

建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。基因库是利用工具酶，通过基因重组技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种核酸扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重组于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。

（一）基因重组

基因重组方案很多，简单的可用同一种限制性内切酶分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端连接酶合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。

（二）转化

转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：

图18-3 基因重组方案之一

⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）接种于Lb agar培养基，37℃培养一晚。挑选3~5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A₅₅₀测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（rec＋，5x10⁷cells/ml）为0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x10⁷cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl₂悬浮菌体。冰浴20分钟，低温离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl₂悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。

⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化 将competent cells（以美国BRL公司DH10B菌株为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059试管中，加10倍稀释的巯基乙醇1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培养皿，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB培养液中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。

LB培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高压灭菌，pH7.5。

SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1mol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。

SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。

四、核酸的分离与纯化

核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞；多种标本中，如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的丰度差异，各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异，因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。溶解细胞的方法因标本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA，用DNA酶除去DNA而获得RNA。目前开发了许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA。其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。

（一）质粒的分离与纯化

含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养，倒入50ml离心管，4℃，3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。（弃去液丢弃前应作消毒处理，以免污染环境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs 2ml，蒸馏水30ml）上下摇匀，置冰水浴5分钟。禁用混匀器，以免DNA分子断裂），加2.5mol/L醋酸钾缓冲液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下摇匀，冰浴5分钟。4℃，3000rpm，离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液，加无水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室温15分钟后，10000rpm离心，弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀，置冰浴10分钟。4℃，10000rpm离心5min，弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA缓冲液，1/10体积的5mg/ml RNase，37℃，30分钟保温。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml异戊醇)，混匀。4℃，10000rpm，离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇，―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清液。加80％乙醇不摇动，直接10000rpm离心，弃上清液，真空干燥。加适量（约200μl）TE溶解。测定含量后备用。

（二）重组质粒中目的基因的分离与纯化

先取少量纯化的重组质粒，用限制性内切酶切出目的基因，经电泳分离，确认。以200μl含2mg DNA（重组质粒）为例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性内切酶，1/10体积缓冲液，1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc，2倍无水乙醇，－70℃，2小时（－20℃过夜），10000rpm，10分钟离心，弃上清液（乙醇沉淀）。适量TE溶解沉淀（切断的DNA质粒与目的基因混合物），电泳分离（用相应分子量DNA标准同时电泳），在紫外光下观察结果，与标准DNA分子量比较，确认目的基因和内切酶的切割效果。

⒈电泳条件：

凝胶制备：	1％琼脂糖凝胶	agarose(mg)	X50TAE(ml)	EB(溴化乙锭μl)
	(agarose)	1000	2.0	4.0
	总体积（ml）
	100

胶浓度（％）：	0.3	0.6	0.7	0.9	1.2	1.5	2.0
DNA长度（kb）：	60-5	20-1	10-0.8	7-0.5	6-0.4	4-0.2	3-0.1
电泳缓冲液：	X50TAE(ml)	EB(μl)	总体积(ml)
	20	30	1000

X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸馏水至1000ml。

EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作应小心)。

经电泳确认后，取适量DNA（重组质粒）同上条件切开，用1.5％低熔点（＜65℃熔解）琼脂糖凝胶，电泳分离。在紫外光下，切出含目的基因区带（凝胶），放入离心管中，提取纯化。

⒉从低熔点凝胶提取，纯化DN****段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DN****段。

（三）标本DNA的分离与纯化

用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)调整细胞为2×10⁷个（组织应切碎置液氮冰冻，高速搅切成粉末后，加入缓冲液）。加1/10-1/20体积（V）10mg/ml蛋白酶（Sigma Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃2小时。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混匀（至少7分钟）。4℃，3000rpm，10分钟。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH8.0)，充分混匀。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重复2-4步骤。测定含量。

（四）样品RNA的分离，纯化

含10⁶个细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐，25mmol/L柠檬酸pH7.0，0.5％肌氨酸（sarcosyl），0.1mol/l 2-巯基乙醇]。总体积为细胞沉淀4-5倍，混匀。加0.1体积2ml/L乙酸钠（pH4.1），1体积酚（重蒸水上封），0.2体积CIAA，混匀器剧烈混合10秒钟。冰水浴15分钟。10000xg4℃，20分钟。离心（不用刹车）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），－20℃，60分钟以上。10000xg，4℃，20分钟离心。弃上清液。用1.5ml离心管约加0.3ml纯化溶液，重复3)步骤，离心10分钟，弃上清液。加75％乙醇，10000xg，4℃，10分钟离心。弃上清液。真空干燥15分钟，备用。

五、探针制备

探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素（如³²P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。³²P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。³²P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用³²P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它同位素标记物，同样应注意放射线防护。

非放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素-酶），经杂交反应最终形成：探针-生物素-血凝素-酶复合物（ABC法）。酶催化底物显色，观察结果。与一般的酶反应底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。化学标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。（表18-1）

表18-1 探针标记及特性

标记物	检测方法	特点
32P	β射线，自显影	灵敏度最高，半寿期14天，放射强度1.7MeV
35S	β射线，自显影	灵敏度高，分辨率好，半寿期87天，0.17MeV
3H	β射线，自显影	低敏度高，分辨率高，半寿期12年，0.01MeV
125I	γ射线，自显影	灵敏度高，分辨率高，半寿期60天，0.04MeV
生物素	酶标血凝素，显色	灵敏度好，避免有内源性生物素标本
地高辛	酶标地高辛配体，显色	灵敏度好，分辨率一般
T-T二聚体	酶标抗二聚体抗体，显色	灵敏度好，紫外照射形成二聚体而标记
BrdU	酶标抗BrdU抗体，显色	灵敏度好，细菌内含质粒复制掺入
铕-补骨脂素	荧光	灵敏度一般

缺口平移标记法先由DNase Ⅰ在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。（图18-4、5）

缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（＞1000bp最好），单链DNA、RNA不能用该法标记。随机引物法具有上述优点，可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记，标记均匀，标记率高，但不能标记环状DNA。利用末端转移酶可进行“尾标”，尾标适用于寡核苷酸探针标记，用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记，因mRNA的多聚（A）尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变检测，该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长，特异性

图18-5 DNA随机引物标记法

好，标记量大，杂交检出信号强。合成探针长度短，一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意碱基组成G≡C含40％-60％，一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构，影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外，还有利用M13噬菌体载体可复制单链DNA的特点，复制合成DNA探针，利用转录载体（DNA），转录合成RNA探针。下面就GIBCo BRL公司（Bethesda Research Laboratories美国）的缺口平移法标记生物素试剂盒（bionick labeling system）为例介绍如下：

试剂：	10x dNTP Mix.250μl	10x Enzyme Mix 250μl
	0.2mmol/L each dCTP，dCTP，dTTP	0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ
	0.1mmol/L dATP	0.0075 units/μl DNase Ⅰ
	0.1mmol/L biotin-14-dATP	50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)
	500mmol/L Tris-HCl(pH7.8)	5mmol/L magnesium acetate
	50mmol/L MgCl2	1mmol/L β-mercaptoethanol
	100mmol/L β-mercaptoethanol	0.1mmol/L phenylmethyl-
		sulfonyl fluoride
	100μg/ml nuclease-free BSA	50％（v/v）glycerol
		100μg/ml nuclease-free BSA
	Control DNA：5μg pBR322 in TE
	stop buffer 300 mM EDTA
	autoclaved H2O

操作步骤：

将5μl 10x dNTP Mix.；－μl DNA（相当1μg需标记的DNA量）；－μl灭菌蒸馏水加至45μl；再加5μl 10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml离心管后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。乙醇沉淀，备用。

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第三节 分子生物学实验诊断技术

一、核酸杂交技术

检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。

杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般³²P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针（＞250个核苷酸）的杂交速率，加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用浓度为5％-10％，浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂，价廉且粘度低，但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的稳定性。理论选用DNA：DNA杂交温度T＝Tm－25℃，此时杂交分子最易形成。但具体实验中影响Tm值的因素很多，一般杂交温度低，形成的杂交分子较稳定。RNA：DNA杂交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA杂交分子的Tm大20-25℃，使得杂交温度提高，此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件最终应在实践中摸索建立。

（一）斑点杂交

将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯膜（PVDF）与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探针分析DNA为例，结果是显色。

取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L)，pH7.0浸15分钟，平铺滤纸在点样抽滤器上，再铺上硝酸纤维滤膜，真空抽气使点样器减压，膜显出凹面。点样50μl（5-10μgDNA，可直接点血清样品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平铺于滤纸上20分钟，变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分别依次把膜平铺于滤纸上，各中和15分钟，中和后膜的pH为7.2-7.5。于80℃，30-45分钟烘干。（RNA分析点样缓冲液系统不同，无需变性，中和，余大致相同）用塑料封口机把膜和2.5ml预杂交缓冲液封入塑料袋中，42℃，水浴30分钟。

预杂交缓冲液：	65℃6xSSC	（原液：20xSSPE）
	5xDenhardt	（50xDenhardt）
	0.5％SDS	（10％SDS）
	100μg/ml变性鲑精DN****段	（1mg/ml）
	42℃增加50％甲酰胺	（原液），配成20ml.

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。过滤后－20℃保存。

探针2ml（50-100ng/2ml预杂交缓冲液）于100℃，10分钟，马上置冰浴5分钟（变性）。加入袋封口。42℃水浴过夜。去杂交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分钟洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封闭：另取袋封入膜和封闭液（蛋白质50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl）2.5ml，37℃，30分钟。去封闭液（可回收）。100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分钟洗二次。亲和反应：酶标抗体3ml（酶有碱性磷酸酶、过氧化物酶等，标记物有抗地高辛、生物素等，现以地高辛标碱性磷酸酶为例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl₂，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分钟。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.5，10ml，1分钟洗一次。取硝基四氮唑兰（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.56ml混匀，37℃，避光反应三小时，显色。蒸馏水洗膜，晾干。观察结果。

（二）Southern blot

1975年E.Southern发明了将DNA切开，电泳分离，再变性，印迹到硝酸纤维（Nc）滤膜上，用探针进行杂交，检测DNA的方法。自显影或显色用于DNA分析。以³²P标记放射性探针为例，放射自显影观察结果。（图18-6）。

图18-6 Southern blot体系

前述分离、纯化的DNA样品5-10μg/100μl TE，加限制性内切酶3Unit/1μgDNA和内切酶相应缓冲液，在相应温度保温1-3小时（不同的酶所用的缓冲液和温度不同），乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA****��。前述电泳条件，与DNA分子量标准品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm电泳（30V12-15小时）。在紫外光下观察Marker充分分离，结束电泳。将胶放入0.5mol/l NaCl，0.5mol/L NaOH液体中30分钟，使DNA变性。同时将膜用蒸馏水浸润，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液体的方盘皿上，放上滤纸两头浸在液体中，依次放上凝胶、膜、滤纸、一尺厚的吸水纸，压力1kg的重物。转移（印迹，blot）过夜。翌日，把膜放在0.5mol/l Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上碱性变性液15-30分钟。戴上手套，用手指压在膜上来回充分洗膜。室温干燥一小时。用塑料封口机，把膜和预杂交缓冲液封在塑料口袋中，注意驱除袋内汽泡。热水浴过夜。探针变性后，加入袋中再封口。热水浴过夜。

洗膜：	2xSSPE，0.5％SDS，总体积200ml，室温30分钟。
	0.4％xSSPE，0.5％SDS，总体积200ml，60℃，30分钟。
	将膜包入塑料袋，在暗室贴在X光底片上。－70℃，自显影1-2天。
	冲片显影，观察结果（背景不清晰可重新洗膜再显影）。

（三）Northern blot

用于RNA分析，电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外，RNA不必变性与中和，电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。

为了防止RNase水解需分析的mRNA，尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小时，灭菌水淋洗干净，100℃干烤15分钟。不能干热灭菌的试剂等，也可加1％DEPC处理12小时（但不能用于Tris）后，100℃。加热15分钟（或高压灭菌15分钟）以抑制、分解RNase。1.0g琼脂糖，灭菌水80ml加热溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，灭菌水至1000ml。样品缓冲液，x50TAE20μl，50％去离子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混匀。约10-30μg/10μl纯化的RNA样品，加二倍（20μl）样品缓冲液（可点样一个凝胶孔lane）。60℃水浴15min，马上置冰浴。加1/10电泳指示剂。点样电泳，75-80V电泳4-5小时（指示剂泳动7～8cm），结束电泳。电泳期间正负极缓冲液要不断交换（可用蠕动泵），以免pH改变。电泳结束，将凝胶放在紫外光下可观察到人rRNA大亚基28S（5.1kb），小亚基18S(2.0kb)，记下大小亚基移动距离（或拍照），可作为被测mRNA分子量分析的参照物。凝胶在50mmol/l NaOH中变性30分钟（低浓度碱，此步可省）。膜在10xSSPE中浸20分钟。用10xSSPE转移过夜（同Southern blot）。80℃1-2小时干燥。用探针杂交后，显影或显色。

（四）原位杂交（insitu hybridization）

在保持细胞形状条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。用于DNA或RNA分析。

细胞用离心涂片机涂片或组织切片置于载玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定时间因标本而异10-20分钟，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/l CaCl₂的0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.3，500W微波炉中照射10-20秒，固定）。马上用PBS洗标本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分钟（因标本和固定条件而定）处理。磷酸盐类缓冲液（PBs NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄8.1mmol/L，KH₂PO₄1.5mmol/L）洗涤。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分钟。预杂交：42℃，1小时。预杂交缓冲液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐温－20，250μg/ml鲑鱼精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。杂交：42℃，4小时。用2x杂交缓冲液（4xSSC，0.2mol/L磷酸钠pH6.5，2xDenhardt）溶解已标记探针，使其终浓度为0.1-1.0μg/ml。DNA检测时把探针覆盖在标本上，置100℃5分钟（变性）取出，杂交。mRNA检测则先把探针置95℃水浴3分钟，立即置冰水浴，再覆盖标本上进行杂交。覆盖标本用液量100-200μl洗涤：2xSSC，50℃过夜。0.2xSSC，室温1小时。载玻片浸在缓冲液中。显色（试剂、方法参照斑点杂交的封闭-显色部分）20分钟-2小时，显微镜下观察结果。

二、核酸扩增技术

通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒，也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法，是在90年代才开展起来的多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，在我国发展很快。目前，PCR技术结合分子生物学实验技术（如逆转录反应杂交技术等）开发了许多PCR新技术（reverse transcriptase PCR；PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；热启动PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于点突变分析；二次PCR特异性好，灵敏度高；热启动PCR可提高特异性。

PCR技术原理是在了解DNA一级结构基础上设计引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可识别并结合引物，以单链DNA为模板，dNTP为底物，合成其互补链。通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。人的DNA扩增引物长度多为20个核甘酸。（图18-7）

图18-7 PCR技术原理

PCR反应：DNA样品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，gelatin（明胶）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。

将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹（杂交）实验、多态分析、探针制备等。

注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆转录酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内（特别3′端）和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G＋C含量为40％-60％。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L对酶有抑制作用。Mg²⁺浓度过高，NDA不易变性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶从嗜热菌分离得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶），现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3～8.8（室温8.3-8.4），反应温度75-80℃，95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐温－20可抵制SDS抑制）。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm－5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品纯化，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。

三、核酸限制性片段长度多态性（RFLP）分析

RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（blot）技术、探针-杂交技术的综合应用，多用于临床遗传性疾病的基因诊断。基本原理是遗传性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、编码区小范围核苷酸序列改变或点突变等。前二者可将纯化的正常人和病人DNA同时用限制性内切酶切成片段，经电泳分离、印迹、探针杂交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性内切酶切开的片段（分子量）大小与正常人发生差异（限制性片段长度多态），使其电泳迁移率发生差异，而达到基因诊断的目的。小区域或点突变，可选用一个限制性内切酶的切点正好在这一变异位置，使切割作用和正常人发生差异（如正常人基因可切断而患者不能，或反之），达到诊断目的。现在PCR产物经变性为DNA单链，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，只要有一个核苷酸发生变异，其电泳迁移率就会改变，进行多态分析（PCR-SSCP）。实际上把基因的异常位置设计在PCR扩增区域内，就能进行多态分析。（图18-8）

核酸纯化→内切酶作用→电泳分离→Southern blot→探针-杂交→显影，显色

图18-8 点突变Eco R1 RFL

四、核酸一级结构（核苷酸序列sequence）分析

核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中，DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法介绍如下。

M13是单链DNA噬菌体，转染宿主菌体复制为双链增殖，又以单链形式透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA（含待测单链DNA的碱基序列），即复制模板。在待测DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，复制链延长。在ddNTP（2′,3′双脱氧核糖核苷三磷酸）存在下，复制延长随机受阻，形成分子量（长度）大小不等的片段。电泳分离，自显影，读图18-9分析碱基序列。

图18-9 核酸碱基序列分析

0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶，高压（1600V）电泳，可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶，自显影，自下往上读图，得到5′→3′的合成链碱基序列，其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。

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第四节 诊断分子生物学技术的临床应用

一种检验方法从建立到临床应用涉及许多因素，关键是临床需要和质量可靠，结果可信、实用二个方面。随着对发病机制研究的不断深入，在分子水平诊断、治疗、预后疾病已为人们所认识。分子生物学技术一般操作较复杂，成本较高，质控较差，但它在基因分子水平揭示发病的机制及本质、诊断、治疗疾病的媚力不可抗拒，人们正在努力改进技术以便符合临床要求。如PCR技术的出现，立即得到临床的响应。

一、诊断分子生物学技术应用范围

外源基因侵入致病，如病毒、细菌、支原体、衣原体、寄生虫等的传统检验、分类方法效率低，往往不能满足临床要求。而外源致病生物侵入体内发病时，拷贝数较高，样品取材、核酸提取相对容易，加之诊断分子生物学技术的灵敏度与特异性，使临床应用价值提高。特别是病毒致病日益猖獗，临床诊断的不断需要，及应用试剂盒的不断开发，操作手续的不断简化，外源基因的检验方法在临床不断得到应用。该领域的发展趋势很可能成为诊断分子生物学技术在临床应用的突破口，应用前景广阔。

内源性基因诊断目前在遗传性疾病诊断方面应用较多，不断向肿瘤（癌基因）及其它领域深入，尚在数据积累，研究阶段。

二、诊断分子生物学技术质量控制

对检验技术的具体要求首先是检验诊断学的质量保证，由完善、合理的实验设计来完成。

⒈特异性杂交技术是通过基因克隆制备探针来完成，PCR是通过引物来完成，RFLP是利用限制内切酶来完成等。即探针、引物、限制性内切酶在反应中都具有特异性。

⒉灵敏度 杂交技术用同位素或酶标记探针，PCR反复扩增20-30次都是提高灵敏度的手段。二次PCR、PCR与Southern blot合用都是典型的例子。

⒊操作简单 杂交技术因操作复杂且费时（需1-2天以上出结果），在临床实验室难以推广。而PCR方法相对简单、快速，故推广迅速。

⒋实验成本分子生物学实验因试剂多数依赖进口，成本高，给临床推广造成一定的困难。试剂国产化是今后的努力方向。

重复性和稳定性也是我们关心的问题，但报告较少。

本世纪生命科学飞跃发展，尤其是近年来分子生物学新技术日新月异，使过去难以想象的实验正在进入常规实验室。以基因结构、基因功能研究为基础，已深入到医学研究各领域，在神经分子生物学、肿瘤分子生物学、基因治疗等医学领域做出了引人注目的成绩。分子生物学技术、诊断分子生物学（基因诊断）、基因治疗已经是医学工作者不可回避的课题。分子生物学技术理论深，内容多，应用广。本章只介绍一些基本知识的技术作为入门，更详尽的内容可参考有关专著和资料。

（蒋纪恺）