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基因诊断是继形态学、生物化学和免疫这诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生和发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。基因是遗传的物质基础，它决定了病原体的生物学特性。除个别病毒外，现知的所有微生物均是以核酸为遗传物质。病原体的基因既可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。基因是决定遗传性状的最基本的功能单位，生物体的完整结构(细胞器、膜结构等)的保证及各种功能的发挥有赖于多种基因的正常表达及相互调节，这些基因构成了一个生物体的完整的基因组。简单病原体的基因组，如某些病毒仅由一致数个基因组成，细菌的基因组则含有数千种基因。但是任何一种病原体均有其独一无二的基因组成和结构，尤其是基因的一级结构，这就为病原体的基因诊断奠定了物质基础。基因诊断的目的就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存在。

一、诊断技术分类

(一)根据目的基因是否被放大分类 可分为杂交法和扩增法。前者被检测的目的基因不被放大，如分支链NDA技术，但用杂交法可以进一步检测经过放大了的基因片段，如PCR产物杂交分析；后者包括PCR及连接酶链反应，Qβ复制酶系统等。

(二)根据被测基因的核酸类型分类 ①在杂交法中，Southern印迹用于检测DNA；Northern印迹用于检测RNA；斑点印迹或称斑点杂交，既可检测DNA也可检测RNA。②PCR法主要用来直接扩增DNA，但是通过逆转录技术，可以将RNA先转变为cDNA再行扩增，称逆转录PCR，如检测HCV、HGV、HIV等。③原位杂交，或原位PCR，也可分DNA或RNA原位杂交和原位PCR或原位逆转录PCR。

(三)根据是否提高了敏感度分类 分支链DNA技术(bDNA)，就是根据固相杂交的原理，采用了一种放大标记探针，目的探针不被放大，但检测信号被放大，从而提高了敏感度；套式或巢式PCR，是用两套引物(内、外引物)作两轮PCR，第二轮PCR是以第一轮PCR的产物作为模板，敏感度进一步提高，常用于极微量病毒基因检测，如检测TT病毒，以及检测大多数RNA病毒(称逆转录套式PCR)。

(四)根据待测标本的性质 分体液(血、尿、粪、痰液、胸腹水等等)、细胞和组织基因检测。①体液中的待测基因可在将标本适当处理后，根据需要采用上述各种方法检测；②组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法；③细胞内病原体基因检测可以通过细胞裂解，释放了待测基因后，采用与体液检测相同的方法，也可将细胞固定于一定载体上，如玻片，或硝酸纤维膜上(如平板上细菌菌落内的基因鉴定)，采用类似于组织基因测定的方法。

(五)根据诊断目的或要求 分为定性诊断、定量诊断和半定量诊断，以及序列分析等。

二、方法和原理

(一)杂交法

1．原理 杂交技术的基本原理是相同的。病原体基因的一级结构中都含有四种碱基：DNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)，RNA为腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。在双链DNA或RNA中这四种碱基以固定关系配对，即A-T(或A-U)，C-G，这种碱基配对关系就构成了DNA或RNA两条链的互补关系，也就是说，两条链之间是严格地通过A对T(或A对U)、C对G的关系结合在一定的。在一定的温度下，这两条链可以打开，变成分离的两条链，但又可以在一定温度下结合起来，这种"再结合"仍然遵循互补原理，但是再结合时的两条互补链是随机碰撞而形成双链的，也就是说再结合后的两条链已经不再是"元配"的了，"杂交"一词就由此而来。如果我们在一条链上"打上标记"，并用它去与另一条链杂交，如果另一条链的确存在，就必然会发生杂交反应，杂交体(新的双链)上也就会被同样带上了标记，再用特定的技术可以探测到标记信号。

2．方法 杂交法中最关键的技术是制备标记探针。标记探针的制备过程包括探针的制备和探针的标记两部分，可分别亦可同步进行。常用的方法有切口平移法、随机引物法、末端标坊法、单链探针制备和标记等。目的还有应用比较广泛的寡核苷酸标记探针，即在寡核苷酸化学合成过程中将标记物(放射性的或非放射性的)掺入或修饰在探针上。

(1)斑点杂交：将待测标本用点状加样法，直接滴加膜上，然后用碱溶液使核酸变性并结合在膜上，再经中和及烘烤(尼龙膜可用紫外线照射)后，与探针进行杂交。

(2)Southern印迹：又称凝胶电泳印迹转移杂交。是电泳技术与杂交技术结合的一种方法。先将待测标本病原体DNA分离，经限制性内切酶消化成一系列片段，进行琼脂糖凝胶电泳，各片段因分子量不同而彼此分开，然后经碱处理凝胶，使DNA****��段变性，在原位将单链核酸吸印到硝酯纤维膜上，经烘干、固定，以放射性核素标记DNA探针进行杂交，最生洗膜和放射自显影，从显影区带鉴定待测标本DN****段。

(3)Northern印迹：是指RNA(主要mRNA)的分子杂交技术。其原理和操作过程基本上与Southern印迹法相同。差别在于电泳标本是RN****段，使用的探针是标记的DNA。

(4)原位杂交：是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种特殊技术。用标记核酸探针，与细胞涂片、压片、细胞悬液滴片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，然后通过放射自显影或酶底物显色或激发荧光等方法检测特定的核酸分子所在的部位。由于本法不需从细胞中提取核酸并可直接观察待测核酸所在的细胞类型、细胞内分布状态与细胞染色体的关系，因此常是检测病毒与细胞关系的极好方法。

(5)微反应板杂交：杂交反应的载体不是硝酸纤维膜或尼龙膜，而是微孔反应板，操作方便，敏感度高。此法快速、简便，不需先抽提核酸，一次可检测大量标本，已广泛用于检测血清或肝组织中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA等。该技术近年来发展较快，预计将取代斑点印迹法。

(二)扩增法 PCR法最常用也是成熟，在此介绍。

1．原理 利用耐热的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶等)在体外条件下，催化一对引物间的特异DN****段合成。它包括变性、退火、延伸三个过程。这3个过程组成一个循环周期，上一个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过n个循环后，靶DNA的拷贝数呈2n增长，可把靶DNA的拷贝数扩大百万倍以上。

2．方法

(1)标本处理：作为PCR的待测标本，单链、双链DNA或RNA均可。如以RNA为起始标本，则需先通过逆转录获得cDNA第一链后才能扩增，此即逆转录PCR(RT-PCR)法。标本中不能混有任何外源和内源性蛋白酶(可降解Taq DNA聚合酶)、核酸酶、DNA多聚酶的抑制剂或能结合DNA的蛋白质。

(2)引物设计：由于引物决定扩增片段的特异性，因此它必须对致病微生物是特异的。可通过计算机进行致病微生物基因资料分析，先选出致病微生物基因组中具有相对独立性与保守性的序列，再设计与该序列两端互补的寡核苷酸片段进行人工合成。