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摘 要 目的 构建可在真核细胞内高效表达白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的真核表达质粒pBK-IL-1ra，以便用于IL-1ra基因治疗研究。方法 采用分子生物学技术将人IL-1ra cDNA插入真核表达载体pBK-CMV中，构建成真核表达质粒pBK-IL-1ra。通过竞争性ELISA、原位杂交和免疫组化检测其在体外和体内转染真核细胞后IL-1ra基因和蛋白的表达。结果 (1)酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实插入片段的正确性。(2)经脂质体介导转染COS-7细胞和滑膜细胞后，用竞争性ELISA方法进行检测结果表明，COS-7细胞在转染pBK-IL-1ra后24和48 h，其培养液中IL-1ra水平较对应空载体转染的细胞明显升高(P＜0.001,P＜0.01)。(3)原位杂交和免疫组化检测结果显示，转染的滑膜细胞IL-1ra mRNA 和 IL-1ra表达都明显高于对照组(P＜0.01,P＜0.05)。(4)将重组质粒pBK-IL-1ra和空载体pBK-CMV一次性肌肉注射于DBA/1小鼠，第4天局部肌肉组织细胞内pBK-IL-1ra表达明显增高(P＜0.01)。结论 通过基因工程方法成功地构建了可在体内外高效表达IL-1ra的真核表达质粒pBK-IL-1ra。 关键词 ：白细胞介素-1受体拮抗剂；真核表达载体；DNA重组技术 白细胞介素-1(IL-1)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它可由多种组织细胞产生，并参与许多疾病的发病。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的发现和基因克隆的成功^［1］，为进一步研究IL-1在疾病中的作用和相关疾病的治疗开辟了新途径。IL-1ra能特异性地与IL-1受体结合而阻断IL-1的生物活性，从而在许多疾病中发挥治疗作用^［2］。本研究通过基因工程方法将IL-1ra cDNA导入到真核表达载体，构建成了可在真核细胞内高效表达IL-1ra mRNA和IL-1ra的质粒pBK-IL-1ra，为采用基因给药方式在体内表达IL-1ra提供条件。 材料和方法

质粒 真核表达载体pBK-CMV (购自Invitrogen公司)可在多数哺乳动物细胞中高效表达外源基因。PGEM-T easy载体购自Promega公司。

细胞株及菌株 滑膜细胞(SFC)株^［3］(北京师范大学生物系王永潮教授惠赠)用含15%胎牛血清的HDMEM培养基传代培养。COS-7细胞(作瞬时表达用)和U937细胞由本室保存。XLI-Blue为大肠杆菌高效转化和克隆化载体，购自美国Stratagene公司。

工具酶 限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、T₄DNA连接酶、Klenow酶和TaqDNA聚合酶等DNA修饰酶及其缓冲液购于Promega、Gibco和BRL公司。ATP购自BRL公司。

hIL-1ra引物 按文献［3］中hIL-1ra cDNA序列设计了含信号肽的hIL-1ra引物。3′端引物：CTTAAGCTTACTCGTCCTCCTGGAAGTAG，5′端引物：ATGGAAATCTGCAGAGGCCT。

试剂盒 总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Gibco公司，质粒纯化试剂盒购自QIANGENGS，cDNA探针标记检测试剂盒购自Boehringer mannheim公司，免疫组化染色试剂盒为ZYMED公司产品，脂质体购自Gibco公司，用于DNA转染。

探针和抗体 采用上述引物经PCR扩增并标记IL-1ra cDNA探针。兔抗人IL-1ra多抗(采用重组IL-1ra做为免疫原，由本室制备)效价1∶500。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(军事医学科学院生产)效价1∶1000。

细胞培养液 RPMI1640和HDMEM均购自Gibco公司。

U937细胞cDNA文库的建立 U937细胞经LPS刺激4 h后，提取RNA，并按试剂盒说明进行逆转录。

IL-1ra的PCR扩增 以U937细胞cDNA文库为模板，加入引物后，95℃变性，5 min后进入以下程序：95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次后72℃延伸10 min。用Promega公司PCR clean up试剂盒纯化PCR产物。

pBK-IL-1ra构建 (1) PGEM-T hIL-1ra的构建：PGEM-T Easy载体是一个开环的两端具有突出T的载体，它可有效地将PCR产物连入，其具有的α-肽可有助于重组克隆的直接挑选。将纯化的PCR产物插入PGEM-T easy载体，挑取阳性克隆后，用EcoRⅠ或PvuⅡ酶切鉴定。(2) pBK-IL-1ra的构建：真核表达载体pBK-CMV和亚克隆质粒PGEM-T hIL-1ra均经HindⅢ和EcoRⅠ酶切、回收并纯化目的片段。酶切后载体pBK-CMV经CIP处理后与含有的IL-1****�片段连接，构建成质粒pBK-IL-1ra。

构建质粒的鉴定和纯化 对pBK-IL-1ra进行酶切和PCR鉴定，对插入片段进行DNA序列检测。采用QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化质粒。

pBK-IL-1ra表达产物的检测 (1)体外表达检测：构建的质粒和空载体经脂质体(lipofectin)同时分别转染COS-7细胞和滑膜细胞，24和48 h后采用竞争抑制性ELISA^［4］检测COS-7细胞培养上清内IL-1ra水平。待测上清及其稀释液首先与含一定浓度IL-1ra抗体的液体混合，再加于事先用IL-1ra包被过的96孔板中，然后用酶标二抗检测剩余的IL-1ra抗体结合到96孔板上的量。因此，样品中IL-1ra含量越高，与其作用后剩余IL-1ra抗体的量越少，酶标二抗所能结合的量也越少，显色也越浅，光密度(OD)值也越小；反之显色深，OD值大。转染滑膜细胞48 h后，采用原位杂交^［5］和免疫组化^［5］的SP法分别检测IL-1ra mRNA和IL-1ra的表达，其结果用计算机作图像分析，并对图像灰度测定结果(OD值)进行统计学分析。(2)体内局部肌肉组织IL-1ra表达的检测：给10周龄DBA/1小鼠后腿肌肉注射0.25%布比卡因80μl，2 d后于小鼠后腿行多点、沿肌纤维走向注射pBK-IL-1ra和pBK-CMV各200μg(200 μl)。用药后第4天，取局部肌肉组织作冰冻切片，用免疫组化SP法检测局部肌肉组织中IL-1ra表达情况，对每例小鼠表达结果进行计算机图像分析。原位杂交中，以不加探针、不加抗体和经Rnase消化处理的细胞的3种杂交作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见蓝紫色颗粒。在免疫组化SP法中，以不加初级抗体和不加次级抗体的标本作为阴性对照，阳性反应者胞浆内可见黄色颗粒沉着。