医学检验信息网 检验医学 2007-2-10 12:41:09

【摘要】 目的 探讨人疱疹病毒6型(HHV-6)感染的免疫发病机理。方法 用逆转录?聚合酶链反应(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素^-10(IL-10)等细胞因子的产生。结果 HHV-6诱导单核细胞表达和产生IL-10，细胞因子mRNA动力学研究发现TNF-α(肿瘤坏死因子)、IL-1β及IL-6随IL-10 mRNA积累而减少，用抗人IL-10单克隆抗体阻断HHV-6诱导的内源性IL-10，TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达和因子产生明显增加，表明HHV-6诱导的内源性IL-10在转录水平能抑制单核细胞因子产生。结论 IL-10具有抑制I类辅助性T细胞(Th1)反应、下调单核/巨噬细胞功能等多种生物作用，推测HHV-6诱导产生的内源性IL-10与该病毒长期潜伏感染及其参予的免疫功能紊乱有关。 Human herpesvirus-6 infection induces IL-10 production in monocytes Li Chengrong,James M Goodrich,Yang Xiqiang Children's Hospital,Chongqing Univesity of Medical Sciences,Chongqing 630014 Abstract In this report,interleukin 10(IL-10)and other cytokines were evaluated through reverse transcription-polymerase chain raction (RT-PCR)and sandwich ELISA to explore possible immune pathogenesis of human herpesvirus 6 (HHV-6) infection.The results showed that IL-10 was expressed in HHV-6 infected monocytes.Kinetic studies found that transcription of IL-1β，IL-6 and TNF-α mRNA decreased with accumulation of IL-10 mRNA.When endogenous IL-10 induced by HHV-6 was blocked using anti-human IL-10 monoclonal antibody,the production and the expression of TNF-α,IL-1βand IL-6 markedly increased as compared with infection by HHV-6 alone,indicating that endogenous IL-10 inhibited cytokine production at the transcription level in HHV-6 infected monocytes.IL-10 has been shown to suppress Th1 response and down-regulate monocyte/macrophage function.The data from our studies suggest that disturbance of immune function and latent infection resulting from HHV-6 infection might partially contribute to endogenous IL-10 production. Key words: Cytokine Interleukin 10 Human herpesvirus 6 人疱疹病毒6型(HHV-6)最初从艾滋病和淋巴细胞增生性疾病分离，其后发现HHV-6感染可导致幼儿急疹、急性单核细胞增多症、肝炎、脑炎等多种临床症候群^［1，2］。HHV-6对单核/巨噬细胞具有明显嗜性，感染后可在单核/巨噬细胞内长期潜伏^［3］，提示该病毒可直接或间接影响单核/巨噬细胞功能。已报道HHV-6诱导白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等单核细胞因子产生^［4］。本组进一步显示HHV-6诱导单核细胞产生IL-10，病毒感染所致的内源性IL-10对TNF-α、IL-1β和IL-6的产生具有抑制作用，本文就内源性IL-10产生的免疫病理意义进行了初步讨论。 1 材料和方法 1.1 单核细胞 用淋巴细胞分离液从5例健康献血者肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)置放PBMC于塑料培养皿37℃1小时，弃去培养液并洗涤3次，所收集的粘附细胞经免疫荧光证实CD14阳性细胞＞95%。 1.2 病毒制备和感染细胞 用HHV-6 GS株(美国威斯康辛医学院Garrigan博士赠送)感染人T细胞株HSB-2细胞，37℃5%CO₂培养8～10天出现明显细胞病变时离心收集细胞，1×10⁷细胞悬浮1ml培养液，干冰冻融3次，离心取上清为病毒贮存液。按描述的方法滴定病毒效价，50%组织培养感染剂量(TCID50)为10⁴/ml。采取同样的处理方法制备未经感染的HSB-2细胞作为细胞对照。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调单核细胞至1×10⁶/ml，病毒感染量为0.0005TCID50/细胞，37℃5%CO₂感染48小时收集上清液测细胞因子，6、12、24、48小时收集细胞抽提总RNA。部分培养病毒感染同时尚加入抗人IL-10单克隆抗体(单克隆BS-10 Biosource International USA)阻断内源性IL-10产生。 1.3 细胞因子测定 采用双抗体夹心ELISA法检测单核细胞培养上清IL-10、IL-1β、IL-6及TNF-α。ELISA试剂盒分别购自美国Genzyme和R and D Systems公司。 1.4 逆转录?聚合酶链反应 用RNAzoIB(Biotex Laboratories USA)提取总RNA，RT反应条件如下：65℃温育总RNA(1μg)5分钟，加入4μl5×RT反应液、100pmol/L Oligo(dT)₁₅(Boehringer.Mamheim)、10mmol/L dNTP、20U rRNasin (Promega)、200U MMLV 逆转录酶(Gibco)和0.5μl 100mmol/L dTT，总反应体积为20μl。逆转录反应37℃60分钟，随后95℃5分钟，终止cDNA合成。取2μl RT产物作50μl常规PCR(200μmol/L dNTP、25pmol/L的等量正反向引物、1.5UTaq聚合酶和5μCi［α³²P］dATP)。按文献合成相应PCR引物^［5，6］并选择PCR条件。PCR引物如下∶β-actin意义链5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′反意义链5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′；IL-1β意义链5′-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTCGC-3′，反意义链5′-ACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGTT-3′；IL-6意义链5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，反意义链5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；TNF-α意义链5′-ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG-3′；TNF-α意义链5′-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCC-3′；IL-10意义链5′-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3′，反意义链5′-TCTCAAGGGGTGGGTCAGCTACCCA-3′。PCR产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，以放射自显影显示结果。 1.5

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