医学检验信息网 检验医学 2007-2-10 12:41:09

【摘要】 目的 进一步了解我国胎儿人细小病毒B19的感染状况及其与自然流产之间的关系。方法 用所建立的套式聚合酶链反应(PCR)技术对50例新鲜的和66例石腊包埋的自然流产组织及25例同期健康孕妇人工流产组织进行人细小病毒B19 DNA检测。结果 显示病例组有34例阳性，阳性率为29.3%，而正常对照组有1例阳性，阳性率为4%。经统计学检验有显著性差异。结论 可能人细小病毒B19感染与自然流产有一定关联。人细小病毒B19可能是致自然流产的重要因素之一。 The study on detection of human parvovirus B19 DNA in spontaneous abortion tissues Xu Dongliang,Zhang Guocheng, Wang Rongping. Department of Pedicatrics of Xijing Hospital,Xian 710032 Abstract 116 spontaneous abortion tissues were detected for human parvovirus B19 (HPV B19)DNA by nested polymerase chain reaction. Of the abortion tissues detected,66 were paraffin embedded and 50 were fresh abortion tissues,At the same time,25 abortion tissues from healthy artificial abortion women were collected as control. The results showed that 27.3%(34/116) of 116 spontaneous abortion tissues were positive for HPV B19 DNA,and only 4%(1/25)were positive in the control group,the discrepancy was significant χ²=5.769(P＜0.05).It suggests that there is a relationship between spontaneous abortion and HPV B19 infection.HPV B19 infection may be an important factor in spontaneous abortion. Key words: Nested polymerase chain reaction Human parvovirus B19 Spontaneous abortion 人细小病毒B19(Human?parvovirus B19,HPV B19),是细小病毒属中同人类疾病密切相关的一种单链、线状小DNA病毒，可引起传染性红斑，一过性再障危象等多种疾病，还可能与非免疫性胎儿水肿、流产、死胎密切相关^［1］，作者已报告我国孕妇及小儿中有HPV B19感染，并从孕妇血中检出HPV B19 DNA^［2，3］。本研究用套式PCR技术检测自然流产组织中HPV B19 DNA，进一步了解我国胎儿HPV B19 感染状况及其与自然流产之间的关系。 1 材料和方法 1.1 标本 病例组50例新鲜自然流产组织采集于1994年4月至1995年4月西安地区五所医院不明原因自然流产的胎儿组织(包括胚胎，绒毛，蜕膜，胎肝等)和66例随机抽取的1991年至1994年西京医院病理科，经石腊包埋的自然流产组织，正常对照组为25例同期健康孕妇人工流产清宫术的胚胎组织。 1.2 主要试剂 引物按文献［4］设计合成。4对引物的碱基顺序分别为，P1(外引物)5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′，P2(外引物)5′-ACACTGAGTTTACTATGGC-3′，P3(内引物)5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′，P4(内引物)5′-CCTTATAATGGTGGCTGGG-3′。所对应的碱基位置分别是2905-2924，4016-3997，3187-3206，3290-3271。两对引物扩增产物长度分别为1?112bp和104bp。HPV B19阳性对照模板由沙特皇家医院研究中心(KFSH Research center)提供。Tag DNA聚合酶、4×dNTPS，HSV试剂盒及CMV试剂盒均由华美生物工程公司提供。猫细小病毒，Adv3,Adv7,RSV的来源同文献［2］。 1.3 胚胎组织中HPV B19 DNA的提取 新鲜组织0.5g剪碎，加入100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA(pH8.0)缓冲液，经组织匀浆后，离心弃上清，加入终浓度为1%的SDS和0.5mg/ml的蛋白酶K，37℃消化48小时，以酚.氯仿.异戊醇(25：24：1)抽提DNA。石蜡包埋的组织先脱蜡，方法是取3张5μm厚切片(切片刀每次切后，均以二甲苯和75%的酒精擦试)放入1.5ml Ependorf管中，加入正辛烷1ml，使石蜡溶解，放室温2小时后离心，100000r/min离心6分钟，再重复1次，使石蜡充分洗脱。脱蜡后组织的酶消化及DNA提取同新鲜组织。 1.4 HPV B19的套式PCR的检测 同文献［5］。取第2次循环产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外分光仪上观察在104bp处出现金黄色电泳带者判为阳性。 1.5 鉴别诊断 34份HPV B19阳性的自然流产组织，以PCR方法(按试剂盒说明书)检测HSV DNA和CMV DNA。 2 结果 2.1 套式PCR的特异性和敏感性 将猫细小病毒，AdV3,AdV7,RSV,HSV,CMV和HPV B19，同批作套式PCR及普通PCR，只有HPV B19在104bp处出现电泳带，其余各病毒均为阴性，特异性检测结果见图1。 图 1 套式PCR特异性 Fig.1 The specificity of nested PCR 1∶PGEM-3ZF Hae III.2∶HPV B19 DNA.3∶Cat parvovirus,HSV,AdV3,AdV7,RSV,CMV.9∶Negative control 将HPV B19 DNA分别稀释为每ml含10pg，100fg,1fg,0.1fg,0.01fg及0.001fg，套式PCR可于0.01fg处仍见电泳带，其敏感性可达0.01fg/ml，而普通PCR仅在大于1fg/ml处见到电泳带，说明套式PCR的敏感性比普通PCR大100倍。敏感性实验结果见图2。 图 2

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