【摘要】 目的
在以逆转录病毒为载体的抗乙型肝炎病毒(HBV)细胞内免疫基因治疗研究过程中，建立较完整的生物安全检测系统，为临床应用奠定基础。
方法
包括无菌，支原体和可复制性逆转录病毒的检测。支原体检测采用聚合酶链反应(PCR)方法，可复制性逆转录病毒的检测应用S
+/L
-试验，NIH3T3细胞扩增试验和neo基因补救分析。结果 在所建立的靶基因包装细胞系中，无菌试验均为阴性，一株包装细胞支原体呈阳性，全部包装细胞系未测到可复制性逆转录病毒。
结论
本研究采用的生物安全检测系统具有稳定性好，敏感染性高的优点，对基因治疗临床试验的生物安全检测具有重要的应用价值。
Bio-safety testing for retroviral vector as gene therapy delivery system
ZHU Minghua, DAI Yimin. Department of Pathology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective
To generate a bio-safety testing system including the testing of sterility, mycoplasma and replication-competent retroviruses(RCR) in the study of gene therapy anti-hepatitis B virus by intracellular immunization.
Methods
Mycoplasma was detected by polymerase chain reaction. S
+/L
- assay, NIH3T3 amplification and rescue assay of neo gene were performed to determine RCR.
Results
The results showed that all of the packaging cell lines were negative for aerobic, anaerobic bacteria and fungi. One of the packaging cell lines was positive for mycoplasma. No RCR was detected in all of the packaging cell lines.
Conclusions
The results suggested that the methods using in present report are stable and sensitive, it is very useful for bio-safety testing of gene therapy in clinical trials.
【Key words
】 Retroviral vector Gene therapy Replication competent retroviruses Mycoplasma 自从1990年9月首次对1例腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症患者进行基因治疗以来，短短的数年内，基因治疗的基础与临床研究迅速发展并不断深入。目前在世界范围内已有120余项基因治疗方案被批准进入临床试验，其中80%以上使用的基因载体为逆转录病毒
［1］。逆转录病毒作为基因治疗载体系统推广到临床应用，除要确定基因治疗方案中具有共性的生物安全性外(如无菌，支原体，同功酶及外源性病毒等的检测)，还要严格检测系统中可能产生的野生型或可复制性逆转录病毒(Replication-competent retroviruses, RCR),对此美国国立卫生研究院(NIH)重组DNA委员会(RAC)和食品-药物管理局(FDA)分别对基因治疗的安全性作了严格的规定
［2］，并有指定实验室进行相应的生物安全检测与鉴定。日本，欧洲等一些国家也相继建立了专门的审验机构，以确保基因治疗的安全。我国基因治疗研究近年来发展迅速，卫生部药政司也于1993年颁发了《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，其中包括有关的生物安全质控标准。但就总的情况看，对基因治疗研究中的生物安全性问题尚缺乏足够的重视，有关可复制性逆转录病毒的检测等研究仅见个别报告
［3］。本文报告在进行抗-HBV细胞内免疫基因治疗研究过程中，对以逆转录病毒为载体所建立的包装细胞系进行无菌、支原体和RCR检测的方法和结果。
1 材料和方法
1.1 包装细胞的建立和包装效率测定 抗人乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)单链抗体基因(SFV)重组至逆转录病毒载体pLXSN, pLNSX, pLXCN和pLNCX。应用磷酸钙共沉淀方法转染至包装细胞系PA317，800 μg/ml G418(Gibco)进行筛选后挑取单克隆并扩大培养。包装效率测定(Clony forming units, CFU)以NIH3T3为靶细胞，简要方法为：取含有病毒颗粒的包装细胞系上清，按10-1～10-4比例稀释，在8 μg/ml polybrene存在的条件下转导NIH3T3细胞2小时，然后用无血清培养液洗3遍，加入800 μg/ml G418继续培养2周，当克隆形成后，用1%结晶紫染色，计算克隆形成数，根据稀释度求得克隆形成单位(CFU)。经测定CFU后，先取滴度高的包装细胞株为母本细胞。本实验共检测了20个细胞系。
1.2 无菌测试 应用无抗菌素培养液连续培养母本细胞4周，取培养上清以常规方法作需氧菌和厌氧菌以及霉菌的培养。
1.3 支原体检测 无抗菌素培养液连续培养母本细胞4周，分别取上清和细胞作支原体检测。检测方法PCR法，试剂盒购自Stratagene公司(#302007)，操作基本按试剂盒推荐方法进行。培养液上清100 μl，煮沸5分钟，10 000 r/min离心10 s，弃上清，沉淀重悬于10 μl树脂缓冲液，再离心10 s，取上清，并以1∶10水稀释，取10 μl作PCR模板。数细胞500个，加入100 μlPBS，煮沸10分钟，10 000 r/min离心10 s，弃上清，沉淀重悬于10 μl树脂缓冲液，再离心10 s，取上清加水到100 μl，取10 μl作PCR模板。PCR条件均按说明书进行，各种缓冲液及所用水均经紫外线处理，操作全部在超净台内进行，以水及缓冲液替代模板DNA作为阴性对照，以试剂盒内的阳性样本及PLC/PRF/5细胞株作阳性对照。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
