医学检验信息网 检验医学 2007-2-11 13:02:21

【摘要】 目的 构建我国人免疫缺陷病毒1型(HIV-1) B、C 和 E各亚型代表株env基因质粒，用于对中国HIV-1进行分型。方法 将与我国HIV-1 B、C 和 E各亚型共享序列最接近的毒株用套式聚合酶链反应(PCR)技术扩增包膜(env)基因，克隆到 pGEM-Teasy载体中，构建成用于异源双链泳动分析(HMA)分型的中国标准亚型质粒，并进行了序列分析和分型的敏感性分析。结果 构建的中国HIV-1 B、C 和 E亚型标准亚型质粒对我国已知亚型的样品进行分析，有清晰的异源双链带形成，形成的异源双链与国外同种亚型质粒与样品形成的异源双链带相比，距同源双链更为接近，分型结果更为精确。中国HIV-1 B、C 和 E亚型标准株的核苷酸序列与国际常用于HMA分型的TH14、IND868、MA959、TH22、等序列比较,相应亚型的核苷酸同源性是：B亚型90.2%, 88.3%，C亚型 83.7%，E 亚型92.3%。结论 采用HMA方法，用中国HIV-1 B、C 和E 各亚型标准质粒对中国HIV-1进行分型，中国HIV-1代表株的HMA各参考亚型质粒提高了中国HMA分型的敏感性，也为世界卫生组织(WHO)艾滋病规划署(UNAIDS)的HIV分离鉴定网增加了供分型的参考亚型质粒。 Cloning the representative strains of China HIV-1 subtypes B, C and E for heteroduplex mobility analysis (HMA) XIAO Yao, YAO Jun, SHAO Yiming, et al. National Center for AIDS Prevention and Control, Beijing 100050 【Abstract】 Objective To clone the HIV-1 env gene and establish the HMA reagents suitable for use with the Chinese HIV strains.Methods Using Nest-PCR technique, we amplified env gene from representative strains which contain the most proximate consensus of China HIV-1 subtypes B, C and E. The genes were then cloned into pGEM-Teasy vector for HMA subtyping.Result The env gene of representative strains of China HIV-1 subtypes B, C and E were amplified and cloned into plasmids. The plasmids were used in HMA and compared with those standard env gene of other countries. The heteroduplex bands obtained with ours env genes were more proximate to homoduplex bands. The homogeneity of the corresponding China HIV-1 subtypes with standard TH14(B), IND868(C), MA959(C) and TH22(E) are 90.2%(B), 88.3%(C), 83.7(C)% and 92.3%(E) respectively.Conclusion The HMA reagents we established in this study have higher sensitivity in HMA analysis for China HIV-1 strains when compared with the international HMA reagents. The HMA reagents also provide new reference reagents for UNAIDS HIV isolation network. 【Key Words】 Heteroduplex mobility assay (HMA) HIV-1 Subtype Plasmid Sequence analysis Sensitive analysis 人类免疫缺陷病毒HIV-1基因高度变异的结果，使其在传播流行过程中产生出许多具有相对独立的基因序列特性的亚型，并在全球范围内形成一定的地区性分布^［1，2］，根据HIV-1基因组中变异最大、同时也是研究最多的膜蛋白基因(env)核苷酸和氨基酸的同源性，目前已确定了由A～J至少10个亚型。各亚型之间的基因离散率是20%～35%，亚型内是7%～20%，个体内是0％～9%^［3-6］。 异源双链泳动分析(HMA)是由华盛顿大学Mullins教授在HIV基因变异分析中建立起来的一种操作简单、省时、适用于对大规模的样品进行分型的方法，目前已在全球HIV分离鉴定网上广泛用于对HIV样品进行分型。我国作为UNAIDS网上成员之一，目前我们用于HIV分型的标准亚型株都来自其他国家，而HIV基因的高度变异性要求我们提高HMA分型的敏感性，根据HIV不同地区流行株间基因高度变异性，按各地实际筛选各亚型代表株克隆作为分型用的标准株^［7，8］，建立适合我国HIV分型的标准亚型株很有必要。我们对全国400余份HIV毒株的亚型进行了DNA序列测定，建立了我国HIV的核酸样品库和各亚型基因序列资料库，据分析发现，我国现在已有A、B、C、D、E、F六个亚型和一个B亚型变种即泰国B亚型。流行的型别居东南亚之首，其中各亚型所占比例是：泰国B亚型47.5%，C亚型34.3%，欧美B亚型5.7%,A亚型占2.1%,F亚型占0.5%,D亚型占0.3%。从结果可以看到,我国现在仍以B、C、E亚型为主。为此，建立适合我国HIV分型的HMA方法，提高HMA在我国用于HIV-1分型的敏感性，更准确的了解HIV-1 在中国的流行情况，对HIV传播途径的控制策略的制定和疫苗的研制有很好的指导作用。 1 材料和方法

1.1 主要试剂、工具酶与试剂盒 Taq DNA聚合酶为PE公司产品；T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶均为Promega公司产品；质粒DNA提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒均为德国Qiagen公司产品；T7 DNA测序试剂盒为Pharmacia公司产品。

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