【摘要】 目的
阐明HBV对感染细胞凋亡的影响。
方法
HepG2及其转染HBV的HepG2.2.15细胞培养中，加MTX、Act D或去血清培养，以FCM检测细胞凋亡率。
结果
HepG2.2.15细胞加MTX后24小时和48小时，凋亡率分别为10.8%和13.3%，加Act D后分别为16.8%和37.7%，去血清后第4天及第6天，分别为13.2%和14.8%；而HepG2细胞加MTX后24小时和48小时，凋亡率则为12.6%和65.3%，加Act D后分别为44.5%和89.7%，去血清后第4天和第6天凋亡率为19.8%和28.8%。
结论
在上述条件下，HepG2.2.15细胞较HepG2细胞耐受凋亡；HBV可能抑制肝癌细胞凋亡。
Tolerance of HepG2
and HepG2.2.15
cell lines to different apoptotic stimuli
ZHU Youfu, LUO Kangxian. Department of Infectious Diseases of Nanfang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective
To elucidate the effect of HBV on hepatocyte apoptosis.
Methods
The HepG2 cells and the HBV transfected HepG2.2.15 cells were cultured with MIX or ActD or cultured in DMEM medium without serum, The apoptosis was examined with FCM.
Results
The apoptotic rates of HepG2.2.15 cells at 24 h and 48 h after MTX addition were 10.8% and 13.3%, at 24 h and 48 h after Act D addition were 16.8% and 37.7%, and at 4 th and 6 th day after serum withdrawal were 13.2% and 14.8%, respectively. While those of HepG2 cells were 12.6% and 65.3%, 44.5% and 89.7%, and 19.8% and 28.8%, correspondingly.
Conclusion
HepG2.2.15 cell was tolerant to these apoptotic stimuli, and it might be inferred that HBV inhibits hepatocyte apoptosis.
【Key words】
Hepatitis B virus Apoptosis 一些病毒可引起感染的细胞凋亡，另一些则抑制凋亡，而且同一病毒的不同表达产物，也可有不同的作用。乙型肝炎病毒(HBV)对凋亡的影响如何，尚少报道。HBV感染及其相关慢性肝病中，发现有肝细胞凋亡，与炎症活性相关
［1］。虽然很多慢性无症状HBV携带者肝细胞中，有大量病毒复制，但罕见凋亡发生，提示HBV并不直接诱导肝细胞凋亡。HepG2细胞是分化较好的人肝癌细胞
［2］，产生蛋白的功能与正常肝细胞近似；转染2拷贝HBV后称为HepG2.2.15细胞
［3］。本研究比较了HepG2与HepG2.2.15细胞对氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)、放线菌素(Act)D及去血清引起凋亡的耐受性。
1 材料和方法
1.1 细胞准备 HepG2细胞系及其已转染HBV的HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞株，引进后在本实验室长期培养。人肝癌细胞系HepG2细胞及其转染HBV的HepG2.2.15细胞，培养于DMEM培养液中(含10%胎牛血清、0.3%谷氨酰胺、青链霉素各100 IU/ml)。
1.2 HepG2和HepG2.2.15细胞的比较实验
1.2.1 对MTX的耐受 6孔板中接种HepG2和HepG2.2.15细胞，洗涤后实验组加MTX10 mg/L, 对照组换入原用的新鲜培养液，37℃，CO2温箱培育，分别收集24小时和48小时组的细胞(包括上清中飘浮的细胞)，洗涤、70%乙醇固定过夜，溴化丙啶(PI，Sigma产品)染色，荧光显微镜摄片，流式细胞仪(美国Coulter公司产品)以溴化丙啶染色的亚G1峰检测其凋亡率。
1.2.2 对ActD的耐受 换用ActD50 μmol/L，实验同上。 图1
A.MTX诱导HepG2细胞凋亡，可见细胞核浓缩及碎裂.B.对照.PI染色 ×400 Fig.1
A: MTX induced HepG2 apoptosis, showing nuclear fragments and condensation. B: Control. PI staining, Magnification ×400. 1.2.3 对去血清的耐受 接种12小时的HepG2和HepG2.2.15细胞，洗涤后实验组换入无血清的基础培养液，对照组换入原用的新鲜培养液，CO2温箱培育，6日内每天收集细胞，同样检测其凋亡率。 2 结果
2.1 对MTX的耐受 HepG2细胞培养中加MTX后12小时开始细胞凋亡，镜下可见细胞浮起，胞体皱缩、出芽，或碎袭成凋亡小体(图1)。流式细胞仪检测HepG2细胞24小时和48小时的凋亡率，分别为12.6%和65.3%；而HepG 2. 2. 15细胞为10.8%和13.3%(图2)。 图2
HepG2及HepG2.2.15细胞对MTX诱导的凋亡的耐受性 Fig.2
Apoptotic sensitivity of HepG2 andHepG2.2.15 cells to MTX 2.2 对Act D的耐受 加入Act D后HepG2细胞24小时和48小时的凋亡率，分别为44.5%和89.7%；而HepG2.2.15细胞为16.8%和37.7%(图3)。 图3
