乙型肝炎病毒基因在动物细胞中复制表达及其应用研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)感染的宿主范围很窄，仅限于人和灵长类动物，这使得对HBV的研究受到限制。HBV细胞模型的建立，为研究其基因突变、蛋白合成、加工、表达以及病毒颗粒最后形成等问题，提供了方便可靠的系统，为进一步分析HBV生物学特性、致病机制以及乙型肝炎的预防、诊断、治疗等奠定基础。本文就近年来HBV基因在动物细胞中复制表达及其应用方面的研究进展，综述如下。 1 HBV DNA转染动物细胞

自从1982年Christman成功地应用磷酸钙沉淀法，将HBV DNA导入NIH3T3细胞以来，将HBV DNA导入HepG2细胞系、Huh6-c15细胞系、Huh-7细胞系、vero细胞系、Ltk-细胞系等，也相继获得成功。由表1可见，HBV DNA转染不同的靶细胞后，其转录物种类有很大差别。Raney等^［1］将HBV DNA分别导入HepG2.1、HepG2、Huh-7和HeLa S3中，研究发现不同的靶细胞产生的HBV mRNA不同，进一步研究发现不同的肝细胞所含的肝细胞核因子(HNF)不同，不同的HNF对HBV大蛋白启动子的转录所起的调节作用也有所不同。Zhang等^［2］应用核衣壳启动子诱变的方法证实，在HepG2.1和HeLa S3中，核衣壳启动子活性决定区位于SP1结合位点的CpB和CpC, 而在HepG2中则位于CpE和CpF。综上所述，启动子活性的组织特异性不同，不同的肝细胞所含HNF不同，可能是导致HBV转录物不同以及表达的病毒蛋白种类不同的原因。所以选择合适的转染细胞，建立更接近HBV自然感染状态的HBV细胞模型，显得尤为重要。

用HBV DNA转染细胞，与HBV自然感染存在一定的距离，不能完全模拟HBV在体内的感染情况。近年来，许多学者用HBV直接感染细胞^［3～7］，以期更接近HBV自然感染(表2)。1988年，Gripon应用HBV直接感染成人肝细胞获得成熟病毒颗粒，HBV感染人胎肝细胞和人肝癌细胞也相继获得了成功。选择各种类型人肝细胞作为靶细胞，可模拟HBV感染人体的状况，使其获得的结论更适合人类。近几年，肝细胞长期原代培养的方法学有了很大的发展，有人在常规胶原被覆培养24小时后再加一层胶原，形成双层凝胶的三明治状培养，可在50天内保持良好的肝细胞功能，为研究HBV生物学特性奠定了基础。

Mabit等研究发现，肝癌细胞在HBV感染后4天分泌3种病毒蛋白：HBsAg、前S1蛋白和前S2蛋白，随后前S2蛋白慢慢减少，但至培养21天仍维持在较高水平，前S1蛋白在培养7天后即迅速下降，至培养21天后消失。Nothern印迹分析显示2.2 kb和2.6 kb两种转录物均存在，但3.5 kb mRNA没有检测到，说明HBV DNA早期转录物编码的仅是外壳蛋白，释放的仅仅是HBV非成熟的核衣壳，并非是完整、成熟的病毒颗粒。

Ochija等用HBV体外感染原代培养人胎肝细胞，在培养上清中检测到成熟的病毒颗粒，收集感染后4～16天的培养上清液，再感染另一胎肝细胞培养系统。结果在后者的培养上清中检测到HBsAg和HBeAg，说明前者的培养上清液具有感染性，提示感染HBV的胎肝细胞能释放具有感染性的成熟病毒颗粒。Hagelstein等用不同pH的缓冲液处理HBV，再感染原代培养的成人肝细胞，用选择性PCR进行检测，发现用pH低于4.3的缓冲液处理后，HBV仍具有感染性，只有当pH降至2.1时，才丧失感染性，说明HBV对酸有较强的抵抗力。

3.1 对HBV基因表达和基因调控的研究 HBV DNA中有4个开放读码框(ORF)，分别表达HBsAg、HBeAg/HBcAg、HBV DNAP、HBxAg。用含不同ORF的重组HBV DNA转染靶细胞对HBV结构基因进行研究。研究发现大蛋白单独表达时，Dane颗粒不能装配，必须要有中蛋白和主蛋白参与。大蛋白单独表达时，HBsAg能正常合成，但不能分泌至细胞外，造成大量HBsAg滞留在肝细胞浆内，形成“毛玻璃样肝细胞”^［8］；前C蛋白氨基末端的29个氨基酸是一种信号肽，与HBeAg分泌有关。进一步研究发现，对信号肽起重要调控作用的是前C基因的1896G和1899G^［9］。HBV前S蛋白有两种异构体，分别位于病毒核衣壳的外面和内面。位于核衣壳外面的前S蛋白能与靶细胞上的病毒受体结合，影响病毒吸附靶细胞；内面的前S蛋白与病毒颗粒的装配有密切关系^［10］。HBV核心启动子进行有规律的转录，对维持HBV正常复制周期非常重要，它调控HBV核心RNA和前基因组RNA的转录。Chen等^［11］研究发现，包含连续4个TA的一段由15个核苷酸组成的序列，对直接、精确地启动核心RNA和前基因组RNA进行转录起着至关重要的作用。由于多数研究仅限于对某一基因片段的研究，而HBV基因内部有调控基因，基因片段间又有相互重叠，研究单一片段难以说明问题。何建文等^［12］将二步法克隆的HBV全基因转染HepG2，在培养上清中检测到有HBsAg和HBeAg表达，转染细胞内HBV DNA的Southern印迹检测显示有HBV复制。