医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:50

【摘要】 目的 应用聚合酶链反应，检测人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)基因与结肠癌及癌区周边组织的相关性。方法 将结肠镜检获取的72例活检标本进行病理检测，其中结肠癌46例，非癌26例(结肠癌周边组织标本10例)，标本用蜡块包埋与固定液两种方法固定，用聚合酶链反应(PCR)特定DNA片段体外扩增法。结果 结、直肠癌人乳头状瘤毒基因检测阳性率43.4%，结、直肠癌周边组织阳性率10%，非癌组织阳性率为0%。结论 癌区组织基因(HPVs)检测率较高，与非癌对照组相比，差异有显著性(P＜0.05),癌组织中HPVs主要以HPV16/33型和HPV18型为主，统计学分析表明结、直肠癌的发生、发展与HPV感染有一定的相关性，尤以HPV16型关系更为密切。 Detection of human papillomavirus gene in biopsies from colon carcinoma by PCR

ZHU Qiupin^*, CAO Jianbiao, LI Shirong, et al. ^*Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

【Abstract】 Objective To detect the human papillomavirus gene (HPVs) in biopsies from colon carcinoma by PCR and to study the relationship between HPV infection and colon carcinoma.Methods 46 biopsies from colon carcinoma, 10 biopsies from tissue around carcinoma and 16 control biopsies were collected and DNA were extracted. The HPV DNA in biopsies were amplified by PCR using general primers (GP) and primers for HPV6/11, HPV16/33 and HPV18.Results 20 out of 46 biopsies from colon carcinoma showed HPV gene positive, HPV6/11, HPV6/33 and HPV18 positivity were 3、11 and 6 respectively. HPV DNA was found in 1 case from 10 biopsies of surroun ding tissue of carcinoma. 16 control biopsies were negative.Conclusion HPV may be related to the etiology of colon carcinoma. 【Key words】 Papillomavirus,human Colorectal neoplasms Polymerase china reaction Gene 人乳头状瘤病毒(HPV)是一类DNA肿瘤病毒，其基因组分为三个功能区：早转录区(E区)、晚转录区(L区)、非转录区(URR)。病毒的癌基因主要包括病毒早期开放阅读框架(Open nedding fzame, ORE)E6区和E7区。一般认为HPV DNA在良性肿瘤或癌前病变中以游离的形式存在，而恶性肿瘤中HPV基因则以单考贝形式整合到细胞原癌基因C-mye启动子附近，造成原癌基因的扩增与激活^［1］。根据HPV基因的同源性不同，目前将HPV分为70多型，按与癌发生关系密切程度将HPV分为高危型、中危型、低危型三群。高危型HPV16、18型等与某些恶性肿瘤的发生关系密切相关^［2，3］。为探讨HPV感染与下消化道恶性肿瘤的关系，对72例下消化道恶性肿瘤组织及肿瘤周边组织，用聚合酶链反应(PCR)检测肿瘤组织中HPV基因(HPVs)。 1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 Taq酶、dNTP.Markers及PCR反应缓冲液购自华美生物工程公司，序列合成由中国科学院微生物所完成，PCR仪为美国PTC-100TM。

1.2 质粒和材料 含有HPV6/11、HPV16/33、HPV18基因的质粒DNA由病毒所谷淑燕教授惠赠，Hela细胞阳性株由病毒所毒种室提供，72份活检标本由北京军区总医院消化内科提供。

1.3 标本的制备 将结、直肠镜检获取的活检标本用蜡块和固定液两种形式冻存，蜡块组织切片5 μm×5二甲苯、无水乙醇脱蜡处理；固定液冻存组织充分研碎匀浆。

1.4 PCR模板DNA 消化液(Tris-HCl 10 mmol/ml、SDS 1%EDTA 50 mmol/ml、蛋白酶K 0.2 mg/ml)加入组织匀浆或切片中，55℃水浴3.5 h，100℃煮佛10 min，酚∶氯仿∶异戊醇抽提，无水乙醇沉淀12 000 r/min 10 min溶于50 μl TE,-20℃冻存。

1.5 引物设计与合成 利用HPV基因组相对保守的L₁区设计，共用引物GP可扩增多种型别HPVs，参照Yoshikawa文献［4］合成序列；特异型HPV6/11、HPV16/33，HPV18参阅文献［5］设计序列。

GP： primer l 5′-CGTAAACGTTTTCCCTATTTTT

TT-3′

primer 2 5′-TACCCTTAAATACTCTGTAATT

G-3′扩增长度263 bp

HPV6/11：primer l 5′-ATGCCTCCACGCTCTGCA

AC-3′

primer 2 5′-CTCTGCCGGTGGTCATGT

GCAT3′扩增长度144 bp

HPV16/33：primer l 5′-TGAGGTATATGACTTTG

CTTTT-3′

primer 2 5′-TAATACACCAATTAA-3′

扩增长度144 bp

HPV18：primer 1 5′-TGTCATAACCTTGAATGT-3′

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