医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:51

关键词： 感受态细胞；液氮速冻；基因工程 中图分类号 Q78 Q813.1^＋1 感受态大肠杆菌细胞的制作和转化是分子生物学领域基因工程中最常用和最基本的技术。目前主要采用电转化法，Hanahan改良法和Cohen改良法^［1］。电转化法效率高，但需要特殊的基因导入仪器，而Hanahan法和Cohen法操作比较繁琐。笔者在实践中摸索出适应快速分子克隆需求，简便实用的改良液氮速冻转化大肠杆菌细胞的方法，可供广大基因工程人员参考。 1 材料和方法 1.1 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α，质粒pGEX-5X-1来自日本东京大学医学科学研究所分子生物学实验室；pQE质粒购自QIAGEN公司。 1.2 试剂 蛋白胨，酵母提取物(OXOID LTD)；琼脂粉(日本进口分装)；其余试剂均为国产分析纯。LB，SOB和SOC培养基按常规配^［2］。 1.3 大肠杆菌细胞的制作 取大肠杆菌DH5α存储菌（LB＋7％DMSO）5μl，涂布于不含氨苄青霉素的LB平皿中，37℃过液培养；取10余个直径为2～3mm的集落，植入100ml LB或SOB培养基中，37℃振摇(200r/min)过夜培养至OD600为0.4～0．8；将培养物等分为a,b,c 3份，a按文献［3］方法直接分装(0.1ml/1.5ml管)，液氮冻存(可转－70℃冰箱保存)；b和c离心(4℃，3000r/min 10min)后加原体积1／10的SOB悬浮，b加7%的DMSO，c不加DMSO，然后分装(0.1ml/1.5ml管)，液氮冻存(可转－70℃冰箱保存)。 1.4 大肠杆菌细胞的转化 取纯化质粒DNA0.5～1μl(0.1μg／μl)放入室温解冻的大肠杆菌细胞中混匀，盖紧后再放入液氮中10～60s冻结；室温解冻后，A：按文献［3］方法不加SOC，直接取10μl(原体积的1／10）涂布于LB琼脂平皿，37℃过夜培养；B：加0.4ml SOC,37℃1h培养后，取50μl(原体积的1／10）涂布于LB琼脂平皿，37℃过夜培养，次日计数LB琼脂平皿上生长的大肠杆菌集落。 2 结果 2.1 不同转化方式对a,b,c 3种方式制作的大肠杆菌细胞集落生成的影响(质粒为pQE30,数据取平均值) 见表1。 表1 不同转化方式对a,b,c方式制作的细胞集落 生成的影响(速冻时间10s)

细胞制作方式	不同转化方式的集落生成数
A(不加SOC)	B(加SOC37℃1h培养)
a	0	0
b	0	1
c	23	81

2.2 不同冻结时间对a,b,c3种方式制作的大肠杆菌细胞集落生成的影响(质粒pGEX－5X－1，数据取平均值) 见表2。 表2 不同冻结时间对a,b,c方式制作的细胞 集落生成的影响

细胞制作方式	不同转化冻结时间(s)的集落生成数
10	20	30	60
a	1	1	3	1
b	0	0	0	无数据
c	85	385	656	281

就DH5α菌及所用质粒而言，比较a,b,c 3种方式制作的大肠杆菌细胞的集落生成数，以c方式制作为好，转化方式以b转化方式较好，转化冻结时间以30s为最佳。由此结果筛选出的最佳液氮速冻法制作和转化大肠杆菌细胞的流程见附图。 附图 改良大肠杆菌液氮速冻转化流程 3 讨论

20世纪80年代以来，基因导入大肠杆菌的方法就逐渐趋成熟。Hanahan等详尽地研究了Ca^2＋、Mn^2＋、Mg^2＋、DMSO、温度等对转化效率的影响，使用Hanahan法，转化效率可达到10⁶～10⁸cfu/μg pBR322^［4］；Cohen法主要采用Ca^2＋处理大肠杆菌细胞，转化效率可达到10⁴cfu／μg^［5］，Dower等^［6］采用基因导入仪转化大肠杆菌细胞，转化效率可高达10⁹cfu/μg。此3种方法都为经典的感受态大肠杆菌制作和转化方法。与此同时，研究者也在根据各自的需要，摸索更快捷、简便、实用的方法^［3、7］。笔者通过实验对照、比较，建立了既简便快速，又较为有效的大肠杆菌细胞液氮速冻转化法。实践已显示此方法能适应日常分子克隆的快速需求。改良液氮速冻法转化大肠杆菌细胞具有以下特点：通过离心，浓缩了单位体积中的大肠杆菌含量；液氮速冻和解冻时，大肠杆菌细胞膜的通透性发生改变，使质粒DNA能进入膜内；单位体积中的大肠杆菌含量增加，可能有助于提高转化效率；加SOC培养基，37℃1h培养，可使速冻后的大肠杆菌细胞在高糖低盐的环境中由于速冻所造成的可逆性损伤更快地恢复，使抗性基因尽快表达；从实验结果可以看出，采用此方案的最佳速冻时间为30s。通过上述改良，在保持液氮速冻法快捷、简便的同时，非常有效地提高了转化效率，转化效率可达10^4～5cfu/μg(表2)。

Hanahan法^［4］中，使用DMSO可使转化效率增加10～15倍，但在液氮速冻法中，情况则相反，DMSO几乎使大肠杆菌细胞完全受到保护(表1、2)，可见不同的条件下，DMSO在转化中所起的作用完全不同。什么情况下采取哪种转化方法完全要根据研究目的而定，如建立cDNA文库，转化大分子质粒，可能采用电转化法或改良的Hanahan法较好，而一般的分子克隆和亚克隆，本实验筛选出的改良液氮速冻法就能体现出简便实用的优点了。

参考文献

1，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T， et al.Molecular cloning:n laboratory manual.2nd ed ,New York:Cold Spring Harbor Press,1989，1～74

2，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T， et al.Molecular cloning:A laboratory manual.2nd ed,New York:Cold Spring Harbor Press,1989，A1～2

3，高桥玲，梁 平，杉山武敏.急速冻结(こよる简便な大肠菌の形质转换法.实验医学，1992；10：78(2480)

4，Hanahan D.Studies on transformation of Escherichia coll with plasmids.J Mol Bilo,1983，166:557

5，Cohen SN,Chang ACY,Hsu L， et al.Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria:genetic transformation of Escherichia coll by Rfactor DNA.Proc Natl Acad Sci USA,1972，69:2110

6，Dower WJ,Miller JF,Ragsdale CW， et al.High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation.Nucleic Acids Research,1988，16:6127

7，奥斯伯F，金斯顿JF，塞德曙JG，等(美).精编分子生物学实验指南.北京：科学出版社，1998，22～23

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