医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:51

关键词： 骨髓移植 巨细胞病毒感染 聚合酶链反应 【摘要 】 目的 为骨髓移植患者寻找较好的诊断和治疗巨细胞病毒（CMV）感染的分子生物学依据。方法 用聚合酶链反应（PCR） 方法测尿中CMV-DNA，逆转录（RT）-PCR法测血中CMV-即刻早期抗原（IE）mRNA。结果 在被测的27例患者103份标本中，发现10例CMV感染者的尿CMV-DNA及血IE mRNA几乎同时阳转。在连续使用抗病毒药甘昔洛瓦（DHPG）治疗的6例患者中，IE mRNA约一周左右阴转，而DNA约20天左右阴转。结论 CMV-IE mRNA可能反映病毒即刻早期转录的停止,对临床抗病毒治疗可能是一个较好的参考指标。 Clinical value of IE-mRNA detection in bone marrow transplantation patients with CMV infection

ZHANG Zheng, LI Li.

Department of Clinical Laboratory, 2nd Clinical Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044

【Abstract 】 Objective To find out a specific marker for diagnosis and treatment of active human cytomegalovirus (CMV) infection in patients with bone marrow transplantation.Methods CMV-DNA in urines was detected by PCR, and CMV-IE mRNA in blood by RT-PCR.Results 103 samples from 27 patients were detected by molecular biology method for CMV. The positive results were got hardly at the same time from CMV DNA and CMV-IE mRNA in 10 patients with CMV infection. In 6 patients treated with DHPG, CMV-IE mRNA first (about one week) become negative, and CMV-DNA turned to be negative on 20 days from the initial treatment of DHPG.Conclusion CMV-IE mRNA may reflect the cessation of virus immediate early transcription, and may be a promising reference value in anti-CMV treatment.

【Key words 】 Bone marrow transplantation Cytomegalovirus infections Polymerase chain reaction

巨细胞病毒（CMV）属疱疹病毒科，是造成临床免疫抑制和低下患者机会感染的重要病原微生物。特别在骨髓移植感染中，如不及时诊治，常可引起致命危险和移植失败。近年，由于甘昔洛瓦（Ganciclovir，DHPG)抗病毒药的临床应用，使CMV感染早期控制成为可能。诊断CMV感染的方法除传统培养及免疫方法外，分子生物学方法对活动性CMV早期感染的发现和疗效监控亦可提供重要信息^［1，2］。我们在优化巨细胞病毒即刻早期抗原信息核糖核酸（CMV-IE mRNA）检测方法基础上，对27例骨髓移植后患者临床标本进行监测，并探讨该方法对诊断早期活动性CMV感染和指导治疗中的价值。

材料和方法 一、临床资料及标本采集

27例骨髓移植后出现发热的患者来源于本院血液病研究所骨髓移植病房。根据病史、临床表现、生化检测及肺X光片，拟诊CMV感染。同时收取患者晨尿及依地酸（EDTA）抗凝外周血3ml为1份标本，连续收取，每周1次，平均每人收取4份标本(1～8份不等)，对初验后提供的10例CMV阳性标本，除1例仅留取2份标本外,均在4份以上。共得103份血尿标本。

二、主要试剂

1.Taq DNA聚合酶购自Promega公司, 序列分析同位素购自Amesh公司；核糖核酸酶（Rnase）及SA-AP均购自国内公司。

2.CMV IE1引物及寡核苷酸探针(用于DNA及RNA目的基因扩增)上游引物：5′ACACGATG-GAGTCCTCTGCC 3′，下游引物： 5′TTCTATG-CCGCACCATGTCC 3′。探针：5′Bio-CGAGGATTG-CAACGAGAACCC3′，上游引物位于IE1基因extron2区,下游引物位于IE1基因extron4区，DNA扩增产物为587bp，RNA扩增产物为303 bp。HLA-DRB1基因引物(以此为内参质控物)上游引物：5′CACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAA3′，下游引物： 5′CCTGTTGGCTGAAGTCCAGAGTGTC3′；上游引物位于extron3，下游引物位于extron4，其DNA的扩增产物是一个607 bp的片段，含intron C，cDNA扩增产物133 bp。以上引物及探针均为Cybersyn公司合成。

3.标准品：AD₁₆₉株购于中国科学院病毒学研究所。

4.主要设备：美国PE公司 PTC-100^TM PCR仪，瑞士HT水浴摇床。

二、方法

1.尿标本500ml以常规酚氯仿提取法提取DNA：扩增条件为予变性94℃5分钟后进行下列循环：94℃30秒，55℃90秒，72℃30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测产物DNA，并用探针杂交证实其特异性^［3］。

2.血逆转录（RT）-PCR测mRNA：先用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法从外周血3 ml中提取总RNA，参考Gema等^［4］法对Mg²⁺用量，退火时间，延伸时间，Taq酶量进行优选。

3.斑点杂交：选用1 nmol/L终浓度，4小时杂交法，证实产物特异性。

4.序列分析：参照标准株进行。

结果

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