梅毒螺旋体低分子量多肽基因的克隆表达及临床应用
梅毒是由苍白螺旋体(T)感染引起的一种严重危害人类健康的性传染性疾病。血清学非特异性试验是目前诊断梅毒的主要方法,例如快速血浆反应素试验(RPR)、不加热血清反应素试验(USR)；应用梅毒螺旋体抗原检测梅毒患者体内的特异性抗体,已被用于确诊梅毒感染,例如荧光螺旋体抗体吸收试验(FAT-ABS)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)等，但使用的均为全抗原，由于可能存在的非特异性交叉反应，使上述方法受到一定的限制。因此，研制一种先进且实用的梅毒诊断及普查的方法已成为当务之急。
近年来，由于分子生物学技术的普及，几种梅毒螺旋体的主要抗原已相继被克隆。在国外，应用梅毒螺旋体重组抗原作为血清学检测方法已经开始［1-3］。下面我们将应用情况报道如下。
一、材料和方法
1.菌株及血清来源：梅毒螺旋体冻干品由沈阳市传染病院性病诊断中心提供。梅毒阳性血清采自沈阳市传染病院性病诊断中心临床确诊的梅毒患者30例,非梅毒患者采用临床确诊为肝炎等疾病，并无梅毒史10例。正常人血清采自无梅毒史者献血员20名。
2.操作技术: 质粒的制备,DNA片段分离回收, DNA连接,细菌转化，GST融合系统的构建, 重组株的培养条件和诱导及表达产物的SDS-PAGE均按常规方法进行。
引物1：5′CG GTGAAAAGAGGTCGGTTCGC 3′
引物2：5′TCC TTACTACCTGCTAATAATGGCTT-CCT 3′
3.亲和层析纯化及亲和层析柱的再生：参照GST系统说明书进行。
4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定表达产物的活性：以抗梅毒螺旋体人血清为一抗，加酶标羊抗人抗体稀释液为二抗,上样及免疫显色均按常规方法进行。
二、结果
1.构建Tp15 000多肽的基因片段与载体pGEX-2T融合表达质粒的:经酶切分析及序列测定为重组菌株pGEX-2T-Tp15。
2.Tp低分子量多肽15 000在E.coli中的表达及纯化: 重组菌株pGEX-2T-Tp15经IPTG诱导，然后用Sepharos 4B 亲和层析柱分离纯化得到可溶性表达的pGEX2T-Tp15 DNA融合蛋白，纯度在90%以上。
3.应用纯化的融合蛋白GST-TP15，联合ELISA的方法检测梅毒患者的血清标本30份，所有样本均为阳性，同时检测非梅毒患者的血清标本30份，所有样本均为阴性，无非特异性交叉反应，并与TPHA对照，符合率达100%。
三、讨论
由于梅毒螺旋体低分子量多肽15 000成分在梅毒感染免疫应答中起重要作用，因此近年来对Tp低分子量抗原成分的研究受到重视。15 000多肽成分是一种低分子量特异性抗原,也是主要的梅毒免疫原。在本研究中，我们采用基因工程的方法获得了表达Tp15 000特异性抗原的重组菌株，又经亲和层析纯化获得足量的15 000抗原纯品，用ELISA方法检测梅毒患者的血清标本30份，所有样本均为阳性，同时检测非梅毒患者的血清标本30份，所有样本均为阴性，无非特异性交叉反应，且此方法操作简便，一次可完成多份标本的检测，试验结果由仪器分析，客观而准确，尤其适用于大样本调查。
参考文献
1 Fujimura K, Ise N, Ueno E, et al. Reactivity of recombinant Treponema pallidum (y-Tp)antigens with anti-Tp antibodies in human syphilitic sera evaluated by ELISA. J Clin Lab Anal, 1997, 11: 315-322.
2 Swancutt MA, Radolf J D, Norgard MV. The 34-kilodalton membrane immunogen of T pallidum is a lipoprotein. Infection and Immunity, 1990, 58: 384.
3 Robin D I, Radolf J D. Expreession in Escherichia coli of the 37 KDa enflagellar sheath protein of T pallidun by use of the polymerase chain reaction and a T7 expression system. Infection and Immunity, 1990, 58: 20-25.
