蛋白质组学分析鉴定技术及临床蛋白质组学的应用
一、蛋白质组学的分析鉴定技术
蛋白质组学研究的核心是将组织或细胞内蛋白质进行分离和鉴定，从中找到与重大生命活动、疾病发生以及生物进化密切相关的关键蛋白质。这也是生命科学研究的重要内容之一。在分离的基础上对样品进行分析鉴定是整个研究过程中的一个重要环节。
(一)、图像分析系统：
获得蛋白质双向电凝胶后，要对凝胶图像进行备份保存，从而以数字化图像的形式存储下来，而且要尽量完整地保留定性和定量信息，以利于进一步的分析。蛋白电泳图像分析系统主要包括二维电泳图像采集系统和二维电泳凝胶分析软件；图像分析所要获得的信息包括每一块凝胶中所得到的总蛋白质点数、2-DE之间的批次重现性、蛋白质点的缺失和出现、多块胶之间蛋白质点表达丰度的定量变化等。
1、 2-DE图像采集系统
常用的采集系统有电感偶合装置(CCD)、光密度扫描仪、激光诱导荧光检测仪等。采集系统所具备的透射扫描功能，可以根据吸光度大小获得蛋白质点的光密度信息。一般来说，光密度值与蛋白质点的表达丰度成正比，下一步的图像分析就是在各蛋白质点密度值相对大小的基础上进行的，即图像采集质量的好坏直接关系到图像分析结果的可靠性。
影响图像采集质量的主要因素是采集系统中扫描透射功能的强弱(扫描系统的分辨率、灵敏度)，以及扫描操作过程中所选择的图像对比度和明亮度。要保证扫描条件的重复性和获得图像的真实性，必须注意扫描强度的校正及各扫描参数(灰度值、对比度、亮度)设定的一致性。
2、 2-DE图像分析系统
(1)、双向凝胶电泳分析软件的工作原理：
围绕每一个已经转化为数字化的图像信息--象素点，构建一个算子(operator)，比较算子中心和边缘的光密度值，比值达到一定强度时该中心点的象素即被认为是蛋白质点的一部分。一个完整的蛋白质点的检出需要此过程的若干次重复。经多年的发展，目前已形成了较为完善的图像分析。
(2)、双向凝胶电泳分析软件的工作流程：
蛋白质点的检测(spot detection)点的检测包括胶内点的定位、点的形状的确定、点的体积(蛋白质丰度)和面积的计算。该步骤是以后各步分析的基础，如果在后续分析中发现点的检测不完善，要重新执行点的检测，上一次点检测基础上的后续分析信息将被清除。因此，尽可能全面的检测，可以减短整个图像分析过程。
有两重点检测的方法：自动执行和手动执行。在背景清晰均匀的情况下，自动执行加上少量的编辑即可完成点的检测。但多数情况是，凝胶背景很不均一，自动功能很难完成点的检测，对于点密集区尤其如此。此时图像分析系统的手动向导可以引导分析者选择最佳的灵敏度、算子以及噪声参数，实现点的检测。
应指出，两种检测方法所得的结果都不可能一步到位，可能仍有一些点未被识别，其可能的原因有：污染物造成的"假点"、各点因距离过近被识别成一个点、因临近点的强度太高而被识别为背景掩盖等。对这些不足之处，图像分析软件提供了进一步的编辑功能，如画点、删点、点切割、提高峰值、边缘增加等，对软件所直接识别出的图像信息进行补充。
背景消减：点检测所得蛋白质点的体积，是该点各象素吸光强度值累加得到的，在凝胶背景较深时，这些背景值会被加到点体积中，从而使蛋白质点体积较实际值偏高。由此，软件中也提供了背景消减功能，包括手动消减和自动消减。若还不能满足要求，可以直接编辑某个点的背景水平。
归一化处理：目的在于对不同胶上的同一蛋白质点进行准确客观的相对定量。一般有两种模式：一种是以全部点体积之和为归一的基础；另一种是基于某一点的归一化处理，该点可以是已知的标志蛋白或人为添加的数值，无论那种情况，必须保证此点在每一块胶上都存在，从而保证在不同胶上进行对比匹配。同理，此一步骤分析是否合理决定后续分析的可靠性。
蛋白质点匹配：第一步是创建参考凝胶，参考凝胶可以是待分析凝胶中的一张，也可以是几个凝胶合并而成的平均胶。匹配过程的两个重要参数：向量框(vector box)和搜索框(search box)。用户可以通过改变这两个参数的大小来操纵匹配。此一过程也分为自动匹配和人工匹配。相应匹配参数的设置则根据实际需要进行调整。 其它：随着图像分析软件的不断完善，除上述基本功能外，各软件的数据校正功能可以排除非目标范围蛋白质所造成的干扰，减轻下一步网上蛋白质搜索的工作量；其统计处理和进化树分析功能，为蛋白数据库的建立提供了依据。
(二)、蛋白质鉴定分析：
经2-DE分离、染色，得到生物样品蛋白质表达谱后，需对蛋白质作进一步的分析鉴定，包括各蛋白质的氨基酸组成分析、蛋白质的定量分析、蛋白质的肽序列分析等 。具体说来就是采用计算机图像分析技术，对所采集的蛋白图谱上的蛋白质点进行定位、定量、图谱比较、差异点寻找等。对胶上蛋白点的鉴定有两种不同的技术路线：一是，将电泳分离开的蛋白质从胶上转印到膜上，然后用Edman降解或氨基酸组成分析等传统生物化学方法进行分析，进入特定的数据库检索系统，实现对蛋白质的鉴定；二是将胶上的蛋白质直接进行酶解，回收酶切片段，采用质谱技术，进入相应数据库检索，实现蛋白质的鉴定。以质谱为基本技术的蛋白质鉴定技术路线，以其灵敏度高、速度快、易实现自动化等特点，已成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。
1、氨基酸组成分析在早期蛋白组学研究中有所应用，是一种传统的蛋白质化学分析法，它的通量和准确度难以满足蛋白质组学研究的需要。
2、质谱鉴定技术
(1)、蛋白芯片技术：
质谱技术中一个很关键的技术环节是蛋白芯片技术。蛋白质首先要被捕获并固定在芯片上，而后又经激光激发、电场加速和检测器的最终检测而获得质谱图。蛋白质芯片和基因芯片一样，同属于生物芯片(biochip) 的范畴，它一般包括2个基本组成部分。
1)固相载体：硅、云母、或各种膜片等经特殊处理后承载吸附各种生物制剂；
2)固相载体上的各种生物制剂(探针)，这些探针可以是某些蛋白的受体或抗体，结合特定离子的化学集团、免疫复合物、酶等。用化学固定法把这些物质固定在固相载体上。
与基因芯片不同，芯片上的蛋白质的三维结构要保持正确，从而保证它们和样品特异性的结合能力，这也是制备蛋白芯片最大的技术难题，一般采用机械手直接点样法，以避免蛋白质空间结构的改变。根据需要的不同，点样芯池的数目也不同。研究用芯片数目较少，规模生产用芯片池的数目则要大得多，所以芯池的数目由数个到上千不等。现已有数种商品化的预制好探针的芯片系统。
(2)、肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)：
PMF基本原理：蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。此外，根据肽段质量数变化，可对基因产生的插入、缺失、突变进行对比分析。从而可以从基因水平理解和阐释相关生理和病理机制，把基因组学和蛋白组学研究有机的结合起来。
