细胞培养技术
一、细胞培养的条件和要求
1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。
目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。
如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min。
橡胶制品：3.6～4.5kg10min。
培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～ 4.5kg10min。
实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min。
试管、吸管等，则可采用干热灭菌；
一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。
细胞培养中常用的消毒剂浓度及其使用场合
2.必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量。
细胞培养中对水的质量要求很高（见水处理）。
3.保证有适量的氧气供应。
细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。
4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。
细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。
5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。
不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）.
6.及时分种，保持合适的细胞密度（见细胞传代）
二、细胞分离
1.人白细胞的分离。
常用于IFN－α和γ的制备。
它主要来源于献血者的静脉血，也可来自手术时体外循环剩余血，分娩时脐带血，以及脾脏和扁桃体等组织。
2.人胚肌皮细胞的分离 。用于IFN-β的制备 。
三.体外培养细胞龄的计算
二倍体细胞龄以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即1瓶细胞传2瓶（1：2分种率）再长满瓶为一世代；1瓶传4瓶（1：4）为二世代；1瓶传8瓶（1：8）则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。
传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。依据每个细胞系的实践经验数据，确保细胞质量及安全，确定生产使用细胞最后限制代次。
四.细胞鉴别试验
新建细胞系或株、细胞库和生产结束时的细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞。可采用遗传特征、DNA指纹图谱、染色体标记、免疫学、HLA和生化法（如同功酶）测定，任选其中一种方法。有简便而能鉴别的方法亦可采用，但需经国家药品检定机构认可。
人二倍细胞株来源于正常人胎肺或其他组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。
1.细胞株的要求
人二倍体细胞株须按下列要求进行全面检定。
（1）建立细胞株必须具备下列资料
建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，终止妊娠原因。
建立细胞株所用的胎儿父母的年龄、职业及健康状况（经医生出具证明），胎儿父及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史。在取胎儿组织前，应做出详细调查。
原始组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长的状况。
细胞培养方法、历史、生长特征和寿命的世代数。
细胞生长液的成分。
（2）细胞株的检定
染色体检查
新 细胞株建株过程中，每8～12世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少有4次染色体检查结果。
细菌、真菌、支原体及病毒检查
致肿瘤性检查 ：每8～12世代，做一次细胞株异种移植试验，观察细胞株有无致瘤性质。
细胞株鉴别试验
2.定义和术语
原代细胞来源，包括猴肾、鸡胚、地鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑胚，以及其他组织等。
原代细胞是用正常组织，以适当的消化液分散细胞进行培养。
原代细胞培养是以适当的消化液消化正常动物组织以分散细胞，培养成单层细胞直接用于生产，只限于原代或少数几代（一般1～5代）内，用于生产的细胞以生物学性状不发生改变为原则。
细胞生长（营养）液：是提供细胞生长繁殖的培养液，可含少量动物血清，多为小牛或胎牛血清（常用10％）。
细胞维持液：是提供细胞维持正常新陈代谢的培养液，不含动物血清（或少量，常用2～5％），只维持细胞正常生存，可满足病毒复制等。
3.鸡胚细胞的分离，在IFN研究中常需要它来制备测定IFN活性的水泡性口炎病毒（VSV），以及用以滴定病毒。
4.常用消化液的配制方法 ：
（1）1％胰蛋白酶溶液的配制：
①取胰蛋白酶10g（一般采用活力为1：250的胰蛋白酶，即1份胰蛋白酶能解离250份酪蛋白）；
②用少量Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状；③补足Hanks液至1L，振摇混匀，置4℃冰箱内过夜；
④用G6玻璃滤器或用分子滤膜过滤除菌；
⑤分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用，同时取样作无菌试验；
⑥使用时用Hanks液稀释成0.25％或0.125％，并用NaHCO3调至pH7.0或偏碱。
（2）0.02％EDTA溶液的配制：
①称取EDTA0.2g；
②用1Lhanks液溶解；
③15～20min高压灭菌；
④分装小瓶，4℃冰箱保存备用。
（3）胰蛋白酶－柠檬酸盐配方：
胰蛋白酶（1：250）2.5g；
柠檬三钠2.96g；
氯化钠6.15g；
酚红（1％）1.5ml；
无离子水加至1L。
用NaOH调至pH7.8（约1mol/L NaOH 2ml），用滤纸粗滤，用G6玻璃漏斗过滤，分装小瓶，低温冰冻保存，并作无菌试验
