聚合酶链反应及其相关技术在临床微生物检测的应用前景

聚合酶链反应（PCR）技术是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，自1985年问世以来，已成为生物医学领域最有价值的研究手段之一^［1］，在临床医学诊断学、治疗学、考古学、农牧业等方面应用广泛。自PCR成为分子生物学的核心技术以来，已解决了很多医学难题，如丙型肝炎病毒（HCV）核苷酸序列的确定，以及临床检测试剂的研制和应用，并促进了反义病毒学技术的发展。特别是本世纪初由世界各国生物学家参加的破译人类全部染色体上基因组的计划中，在2003年将排出人类30亿核苷酸序列，使人类对自身从分子水平有一个里程碑认识的飞越，这一计划依靠的主要技术是以PCR为基础。这一技术是二十世纪末最重要的有价值的医学发明之一。

近年，PCR技术作为实验医学中最有利用价值的方法之一，开辟了临床分子微生物学领域，只要有已知的部分的DNA序列（或RNA序列）及感染的组织或体液标本，运用PCR技术即可检测任何病原体，这是其他检测方法无法替代的。一些病原微生物的感染有泛滥和蔓延的趋势，特别是病毒感染，有些病毒目前尚无成功的培养分离方法，从而给诊断带来一定的困难，如HCV、人乳头瘤病毒（HPV）等；有的是目前虽有检测方法，但因耗时长、操作复杂、敏感性差，在临床实用有一定局限，如沙眼衣原体、军团菌、分枝杆菌等检测；免疫学抗体检测虽操作简便，但无法判定是否为现症感染或既往感染。而应用PCR技术可直接检测病原体，尤其针对常规检测方法灵敏度低、费时或难以判断预后，或不能对具有治疗意义的亚群进行预测的病原体，则更有价值。PCR技术的不断发展与完善，推动了临床微生物的检测进展。从检测种类看，涉及多种病原体，从细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体、螺旋体到寄生虫；研究内容有技术方法的探讨，有微生物基因的分析、分型、变异及耐药等多方面临床实用课题。从本刊近几年发表的文章看，也充分体现了这一点，涉及PCR技术的文章数量及质量均逐年上升^［2］。

PCR技术其高敏感性是众所周知的，但同时也引出一些问题。近年由于PCR技术应用过滥，有的实验室只顾经济利益，不顾技术要求，影响了这一技术的质量和信誉，故卫生行政部门曾一度令其暂停整顿。在实用中，PCR技术存在问题较多的是假阴、假阳性结果的出现。假阳性结果主要是污染造成，因此要求PCR技术必须规范化，要有标准的实验室设置；模板提取和贮存规定；操作中有防污染措施（如单行路线工作、一次性用具使用等）；试剂盒要设有防污染系统（如使用尿苷酶或设置毛细管PCR等）等。假阴性结果与标本处理、试剂的配制及操作中优化条件选择有关。标本中存在Taq酶抑制物（如血红蛋白、较高浓度尿素等）；有些提取DNA或RNA方法不当（如含杂蛋白过高标本不液化、直接以水煮法提DNA、蛋白凝固包裹了DNA，影响模板提取量）；试剂反复冻融、Taq酶失活、阳性对照降解；试验中条件选择不当，均可引起假阴性结果。特别在RNA的检测中，如果不注意RNA酶污染，而使模板降解，可出现假阴性。为了规范这一技术，卫生行政部门将逐步采取认证实验室、培训上岗人员、限项收费等多种措施，引导这一技术在应用中正确健康发展。

排除了各种人为因素造成的假阳性、假阴性之后，PCR技术检测病原微生物仍存在一定问题，如操作繁琐，无法进行大规模样品分析；结果判断主观性强，缺乏客观标准，不利于标准化、自动化；不能真正做到对模板中核酸进行定量分析；高度敏感性使得临床医生难以判断检出的微生物是否致病等等。针对这些问题，几年前，除已应用的巢式扩增、原位PCR、逆转录PCR、连接酶链反应外，近年发展起来的还有转录依赖的放大系统、链替代扩增、实时荧光PCR定量检测技术等^［3］。如定量PCR方法主要有竞争PCR及实时定量PCR，且均依赖于荧光标记的探针，前者是最常用的定量PCR之一，而后者是近年来发展起来的倍受关注的定量PCR技术^［4］。除定量PCR外，还有分支DNA信号放大系统、核酸序列放大系统等相关技术，主要用于病毒核酸的定量检测，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、HCV、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒等^［4］，以及用药后的治疗监测情况，为临床早期诊断、及时治疗提供有价值的资料。在本期重点文章中即有多篇应用PCR技术检测病原微生物的报道。另外在临床应用方面，耐药基因的监测也成为一大热门话题，无论是耐甲氧苯西林金黄色葡萄球菌，还是超广谱β-内酰胺酶的检测^［6］，也还是涉及耐万古霉素肠球菌耐药性分析，均离不开分子生物学PCR技术。PCR技术在临床微生物检测中应用范围之广，解决问题之深入，都是前所未有的，因此有极高的实用价值。

PCR技术应用于临床微生物检测所带来的实验设备更新的前景也是无限的。目前国外PCR试剂盒发展的主要趋势，是从手工操作向自动化过渡，从定性向定量发展。由国内外厂家生产的PCR全自动检测仪，有的已通过美国食品与药品管理局批准，但由于价格昂贵，尚不能被使用单位广泛接受。另外还有类似96孔板的PCR杂交法，作为定量PCR方法已被批准用于HIV、HBV、HCV的检测。目前我国临床实验室暂规定应用酶切、杂交、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法，对PCR产物进行分析，以提高PCR的特异性。但从样品制备到试验结果的PCR技术全自动化，是我们努力的方向。期待不久的将来，PCR技术将象自动生化仪、自动ELISA分析仪一样，进入临床检验室。真正做到方法简便、快速、敏感、特异，而被广泛应用于临床。

近年来生物芯片技术在微生物检测方面的应用，也向我们提出了新的挑战，挑战的核心是增大信息量，缩小实验室的空间^［7］。蛋白芯片、DNA芯片、细胞芯片、组织芯片技术都在发展中，并将PCR技术应用于其中，希望通过一次检测，即可获得临床所需要得到的全部信息，这就要求有微型PCR装置。有关专家现已着手微缩芯片的研究，我们期望尽快有更高新的技术使临床微生物检测跃上新台阶。

参考文献

1 Baumforth KR, Nelson PN, Digby J E, et al. Demystified......the polymerase chain reaction. Mol pathol, 1999, 52:1-10.

2 叶应妩，马纪平，李家宏，等.我国临床微生物学检验50年.中华医学检验杂志，1999，22：261-263.

3 Lisby G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbiology. Mol Biothechnol, 1999,12:75-99.

4 Orlando C, Pinzani P, Pazzagli M. Developments in quantitative PCR. Clin chem Lab Med, 1998,36:255-269.

5 Hodinka RL. The clinical utility of viral quantitation using molecular methods. Clin Diagn Virol, 1998,10:25-47.

6 王志军，倪语星.超广谱TEM β-内酰胺酶检测及分型.中华医学检验杂志，1999，22：347-348.

7 Whitcombe D, Newton CR, Little S. Advance in approaches to DNA based diagnostics. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9:602-608