聚合酶链反应技术在医学检验中的应用和展望
聚合酶链反应(PCR)技术已使基因诊断逐步成为诊断疾病的常规技术之一。在我国，PCR技术介入医学检验领域已近10年，从爆炸性展开到暂停使用，经历了一段曲折的发展过程。现在已到了冷静分析其存在问题，客观评价其应用价值，促进其健康发展的关键时期。
一、PCR技术在现代医学检验中的地位
科学研究已证明，人类疾病大都直接或间接与基因有关。基因诊断被公认为实验诊断的发展方向。有专家认为，实验诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正进入基因诊断的新时代。生化和免疫诊断是根据表型诊断疾病，基因诊断则是从本质上认识疾病。1995年，美国国家临床检验标准化委员会(NCCLS)发表了关于感染性疾病分子诊断应用准则的文件。该文详细论述了分子诊断应用范围、条件和质量控制细则［1］。NCCLS分子微生物委员会主席Enns断言，以基因探针和基因扩增为主的分子生物学方法将取代传统的病原体培养和生化检测方法。1998年，国际临床化学学会发布了关于分子扩增(主要指PCR)在临床诊断中应用的质量评估基础的文件。该文件肯定了PCR作为临床常规检验技术的良好发展前景，对PCR操作的各个环节进行了详细论述［2］。上述两个权威性文件都特别声明，以PCR技术为主的基因扩增技术本身在不断发展变化，目前只能是确立某些原则，尚难统一规定实验室质量控制标准。
国际上有关统计资料表明，核酸技术(主要是PCR)用于诊断感染性疾病每年已超过1 000万人次。美国疾病控制司有关专家的报告称，他们正在考虑把PCR技术列入性病监控手段和作为扩大性病病原体检测的金标准，并预计在今后几年中，把它作为疾病的常规诊断技术。
二、PCR技术在临床应用中的问题和对策
在我国，前一个时期PCR应用相当混乱。从技术因素分析，常规PCR作为临床检验技术存在的最主要的问题是，扩增产物污染带来的假阳性。一个阳性样品的扩增产物可高达成千上万亿个分子拷贝，在完全开放状态下检测扩增产物，不可避免会造成实验室污染。核酸分子稳定性又使得产物难以被破坏和清除。只要实验室被扩增产物污染，扩增片段随时有机会掉落到新处理样品中，又被同一PCR反应体系扩增出来而产生假阳性。杜绝产物污染带来假阳性的根本措施是，在封闭状态下进行扩增和产物分析。常规PCR只能定性不能定量，也影响了评价PCR检测结果的临床诊断意义。定量是PCR作为临床检验技术发展的另一个重要目标。最近，国外发展了一种荧光基因探针杂交定量PCR技术。在本期有关定量PCR的论著中，也有一篇对荧光定量PCR技术作了报道。该技术把基因扩增PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题，并且通过探针杂交进一步提高了特异性，为PCR临床应用带来曙光。
三、新一代PCR技术的临床应用前景
1.感染性疾病。PCR在医学检验学中最有价值的应用领域，就是对感染性疾病的诊断［3］。只要有限的核酸序列是清楚的，运用PCR技术，就可以检测任何病原体。目前，对一些培养周期长或缺乏稳定可靠的检测手段的病原体，可首先考虑用PCR检测，为临床诊断提供依据。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10～102基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105～7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。另外，抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时，也需要用PCR方法来确定。
定量PCR研究资料已表明，病原体感染后的发病时间和病情轻重均与病原体数量相关。例如：人类免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关，甚至可根据HIV的量准确预测发病时间。在肝炎等其他病毒感染性疾病中是否存在类似情况？一些病原体的致畸和致变作用是否与病原体的量有关？这些均需定量PCR技术来阐明。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素治疗对肝炎病毒高拷贝者不敏感，低拷贝者敏感，而有些药物则具有显著降低病毒高拷贝的作用。进行肝炎病毒的定量检测，不仅为寻找有效的肝炎治疗药物和措施提供了方便，同时又为选择肝炎治疗药物和制订治疗方案提供了科学依据。
2.肿瘤。尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚，但相关基因的遗传学改变的累积，是致癌性转变的根本原因已得到普遍接受。遗传学改变主要引起癌基因激活和抗癌基因的失活。基因突变、缺失、插入、扩增、易位等常见遗传学改变在细胞癌变的过程中都可见到。PCR技术是检测这些遗传学改变最简便和有效的手段。
癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。PCR技术不但能有效地检测基因的突变，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。
某些癌基因的遗传学变化的检测几乎已达到确诊某些肿瘤的程度。例如，CD44基因的异常拼接表达，几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤，而对照组完全没有这种异常表达［4］。几乎所有慢性骨髓性白血病患者都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技术不但可通过检测BCR/ABL融合基因的表达而进行肿瘤诊断，还可检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。
肿瘤标志物也是肿瘤诊断的热门研究领域。用定量逆转录(RT)-PCR方法，一般条件下可检出10～102某种标志物的mRNA，而蛋白检测方法需108个分子才可检测到。研究表明，癌细胞，甚至癌前期细胞在进入血液循环后，通过外周血中肿瘤特异性标志物mRNA的定量RT-PCR检测，可检测出进入外周血的肿瘤细胞的数量，据此不但可以进行实体肿瘤筛查，而且可检测肿瘤手术后，淋巴转移阴性的病人外周血肿瘤细胞量的多少，以估计肿瘤的复发和转移，制订合理的治疗方案。
在肿瘤化疗过程中，肿瘤耐药基因(MDR)1表达是一个受到重视的问题。MDR在不同组织的肿瘤表达是不一样的，用定量RT-PCR检测MDR1基因表达水平，是选择化疗药物的依据。
3.遗传病。PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。十几年来，该技术在遗传病诊断的临床应用方面有了重大进展。从使用范围看，它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变、缺失及表达量的异常；从灵敏度方面看，它能从单细胞进行特异基因扩增，实现植入前基因诊断。多色荧光标记探针的PCR技术，可在单反应管中检测出样品是纯合还是杂合基因突变或缺失。PCR产物直接测序也成为检测遗传病基因突变的常用方法。
参考文献1 Enns RK, Bromley SE, Day SP, et al. Molecular diagnostic methods for infectious diseases; approved guideline. Natl Commit Clin Lab Stand, 1995, 1-10.
2 Neumaier M, Braun A, Wagener C. Fundamentals of quiality assessment of molecular amplification methods in clinical diagnostics (IFCC document). Clin Chem, 1998, 44: 12-26.
3 Tang YW, Procop GW, Persing DH. Molecular diagnostics of infectious diseases. Clin Chem, 1997, 43: 2021-2038.
4 Raj Gv, Moreno JG, Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detetion of solid tumors. Cancer, 1998, 82:1419-1441.
