应用分子检测进行诊断、治疗选择及疾病监测
? 机制不同
? “严重”程度不同
HIV 突变的解释和定义
? 初级突变 – 通常早期选出，并且对药物有观察到的敏感性
? 次级突变 –病毒适应，酶活性增强，多个次级突变可引起耐药性
? 多药耐药突变 – 通常对某一种类中的所有药物耐药。
? 天然的多态性 – 在没有药物作用的情况下，在野生种群中传播的突变
与耐药有关突变的表
与 NRTI 耐药相关的突变
解释规则
? 使用测序结果和计算机运算法则来阐述对测序数据解释的难点，如何做？
用计算机软件确定是初级突变还是次级突变，
初级突变比次级突变更易引起耐药，
多种次级突变可引起耐药。
关系型数据库
? 将表型结果与分离株序列数据结合，提供突变解释
? 由于它给临床医生提供基因型-表型-临床数据，为未来分子诊断检测报告建立模型
基因型 – 表型 数据库
虚拟表型-优点
? 快速、客观、定量
? 基于突变模式识别和突变表型检索
? 要求有实质性的数据库
? 提供序列信息
? 结合多种方法的优点
? 能鉴定混合物
虚拟表型-局限性
? 间接检测耐药
? 依赖数据库, 特别是
? 在数据库中没有相匹配新药或新的联合用药数据
? 非 B 型可能没有准确的解释
? Complex mutation patterns may result a rules base report due to the lack of matches in the database
对Mtb 的耐药
可用于诊断和选择治疗的测定
? 开发能同时检测和确定最佳治疗方案的平台
? 应用于结核杆菌
? 耐药
? HPV 基因分型
? 提供基因分型信息用于鉴定新的不同的HPV型感染
? 用于接种HPV 6、11、16 和18 型或 HPV 16 和 18 型疫苗患者的随访
Lui Y et a. Drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in a nationwide epidemiological survey in China in the year of 2000]
Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2002 Apr;25(4):224-7
为何检测 HPV?
? 决定是否进行阴道镜检查、活检或其它侵入性的检查方法
宫颈Pap涂片的敏感性
HPV 试验 – 实质性事实
? HPV 是宫颈癌的主要病因因子
? 高危险HPV检测和至少250X增加了高等级CIN的危险性
? 帮助鉴别不确定的细胞学结果和持续性感染。
信号扩增 (HC)
Digene杂交捕获
? 高危险性基因位点 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 and 68.
? 敏感度达1000拷贝。
? HC 试剂盒的优越性:
TAT(<2 天), 样本收集和处理容易, 与PCR相比减少了人工 (不要DNA提取这一步) 和污染的危险性减小了。
? HC 试剂盒的缺点:
没有证实细胞结构的对照；除非进行大量测试，否则由于需要大量对照试验而花费较大；需要很多步骤。
杂交捕获技术
核酸杂交检测,用化学发光检测信号扩增
Step 3:在固相载体上（ 微孔板或试管）捕获RNA:DNA 杂交体
靶扩增 (PCR):
一致同意的引物可以扩增所有的 HPV; 伴随区别方法的一种PCR 反应 (e.g. RFLP or probe ELISA)
优点:
1)对非常低的量也敏感 (10-100 HPV DNA ，在含有 <5 X 104 细胞的组织中)
2) 类型鉴别.
缺点:
1) 有因污染引起假阳性的风险
2) 需3个房间或区域
3) 需要高水平的技术人员，大多数测试不能自动化
对多种分析物进行检测的其他技术平台
? Nanogen用固相阵列进行感染性疾病的测试
? Luminex 用微珠和激光来检测样本中多种分析物
? 使用的是液相阵列技术而不是以前的固相阵列技术
检测技术
? 使用经证实的xMAP技术
? 颜色编码微球
? 激光
? 高速数显信号处理器
? 开放性设计
? 进行多种生物分析
检测技术
检测技术
感 谢
? Pauline Lau, Chair of Organizing Committee
? Cepheid, Virco, Digene and Autogenomics for slides
? Hazim Najjar for slides on HPV
? Dr. Zhen-Hua Yang for translating slides
? Contact:
? deborah.payne@utsouthwestern.edu
