分子生物学实验室质量保证和能力比对
分子生物学实验室质量保证和能力比对
Janine Cisek ,MT(ASCP),CLSp(MB)
Saint Luke’s hospital
Kansas City,MO
jcisek@saint-lukes.org
Saint Luke 医院分子诊断部介绍
?十年的检验历史
?传染性疾病和基因检测
?常规和实时PCR，线性探针分析
?六FTEs
?卓越的Roche 分子中心
目的
?制定分子生物学实验室的策略:以保证实室检验的和维持实验室人员的能力
?解释分子生物学实验相关的常规问题
?提供如何评传分子实验室质量保证的范例
质量保证
?必须监测实验中的可变因素
?分析前
?分析中
?分析后
?必须遵守检验管理的规定
?管理机构（FDA，CLIA)
?认可机构（CAP，ACMG)
能力
能力评价
?室间比较
?CAP调查
?CAP认可的替补方法
?室内比较
?个人熟练核查表
?所有员工轮流参加CAP调查
?与其它手工方法的比较
CAP分子病理检验核查表
分子实验的QA/比对常见问题
?成本--器材保养、购买能力比对样品
?劳务—学习、进行能力比对检验需要花费时间
?广泛制定文件
?管理机构可能阻碍方法的发展
管理规定-CLIA88
CLIA（临床实验室改进修正案）
?1988年国会通过建立实验室实验质量标准
?在CLIA下所有从事分子诊断实验的实验室都被分为A类高度复杂实验室
FDA医药产品分类
?ASR (分析特殊试剂）：手工实验的活性成分；ASR规则要求生产商和用户遵守规定确保试剂的标识合理和评估试剂.
?RUO (仅用于研究）：正在临床评估和确定使用性的医学产品.
FDA医药产品分类（继续）
?IUO(仅用于调查）：已被认可的有效产品；产品可被学术机构用于建立其性能特征
?IVD（体外诊断）：按其用途可进行商业检验的产品
分子实验室分区
?一区：试剂准备区
?非空气循环操作箱，紫外去污设施
?二区：标本准备区
?生物安全柜，层流
?三区：扩增后区
?热循环仪，板检测仪
实验室布局设计
?单向工作流程
? 工作一区 二区 三区
? 三区样品绝不能返回二区或一区
?气流卢坐
?设计时考虑空气管道系统
?实验室气候
?分子实验用的酶对下列因素敏感：
?强氧化剂产生的蒸气
?极端温度
?极端湿度
工程控制
?每区应有自已的实验室供应品、存储设备、隔离衣和手套；
?只能使用一次性隔绝气溶胶枪头；
?防止扩增产物污染试剂/ 样品准备区的鞋套
?样品和试剂分开冷藏
干浴优于水浴
?为防止气溶胶污染，离心机应远离一区
人员
?资格
?专业化
?能很好组织
?熟悉无菌技术
?有处理问题能力
?培训
?新的在分子生物学的人员聘用计划
?年度能力评估
?继续教育计划
设 备
?类型：注加器、天平、离心机、
热循环仪、定时器、不间断电源
?每日/每月QC
?确定可耐受限
?维护
?校准
?文件记录
分 子 技 术
?核酸扩增(NAA)
?基于靶物扩增、探针、信号（如PCR、SDA、LCR, bDNA)
?DNA测序
?目的DNA核酸序列
?Southern 杂交(SBA)
?包括电转分离DNA到膜上
?荧光原位杂交(FISH)
?用荧光标记核酸探针检测组织和细胞中特定的DNA或RNA
关键步骤
定义：
是指可能出现错误和相反结果的步骤，
这些步骤要严格监测。
PCR关键步骤
?DNA分离
?引物
?扩增
?检测
?解释
测序关键步骤
?样品的获取
?标本准备
?PCR
?测序
?数据分析
?结果报告
SBA关键步骤
?样品获取
?DNA提取
?DNA检测
?凝胶电泳和转移
?DNA杂交和标记
?使用对照茄
?解释和结果积分
FISH关键步骤
?可行性、确证性预实验
?标本接收和医师申靖
?样品准备
?蛋白酶消化
?DNA变性
?探针杂交
?冲洗
?分析
?解释和报告
分子实验结果分析前的质量保证
关注
?标本收集和处理
?试剂
?污染
?抑制
样品收集和处理
?收集：
?抗凝剂：肝素和DNA相互作用,抑制DNA扩增
?处理：
离心转速、持续时间、和离心温度
?标本贮存温度
污 染 控 制
?预防
?前处理区和后扩增区分开
?专用的设备、隔离气溶胶枪头
?使用Amperase（尿嘧啶腺甘糖基化酶)
?污染监测
?Swipe试验
?监测空白对照（背景影响）
识别抑制
?含有目的DNA/RNA特异的探针结合位点的DNA或RNA序列,但有一个特定的探针结合部位
?室内控制(IC)：定性的
?定量标准(QS)：定量的
分析分子中的QA
