人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌中的高效表达
WANG Wenying*, ZHOU Lanping, SUN Yazhou. * Beijing Friendship Hospital, * Beijing 100050
【Abstract】 Objective To study the expression of HPV16 capsid proteins L1 and L2 in E.coli.Methods The plasmids pET-30a-L1 and pET-30a-L2 were constructed from the pET-30a vector, and transducted into the BL21. The fusion proteins 6×His-L1 and 6×His-L2 were expressed when induced by adding of IPTG. SDS-PAGE and Western blot analyses were used to detect the expressed proteins.Results Fusion proteins 6×His-L1 and 6×His-L2 were expressed efficiently in E. coli, the Mr were about 60 000 and 97 000 respectively, 6×His-L1 degraded more than 6×His-L2 .Conclusion L1 and L2 proteins were expressed at a high level in prokaryotic expression system, and L2 protein were more stable than L1 protein. 【Key words】 Papillomavirus,human Gene protein expression Cancer 人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)基因组由三个部分组成：长控制区(LCR)又称上游调节区(URR)，或非编码区(NCR)；早期区，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7；晚期区，包括L1和L2；L1核苷酸序列约1.5 kb， 编码主要结构蛋白L1，相对分子质量约为58 000，L2核苷酸序列约1.5 kb，编码次要结构蛋白L2，相对分子质量约为55 000［1］。HPVL2和L2基因结构简单，变异性很小，即使发生变异，也不影响蛋白抗原的免疫原性［2］。HPV型别的确定，是根据新克隆HPV的E6、E7或L1的开放读码框架(ORFs)的核苷酸序列与已知型别的相应序列相比，同源性小于90%以上者为新型，同源性大于90%者为亚型［3］。目前已发现70多型HPV，根据各型别损害和致癌性，可分为高危型和低危型HPV。粘膜低危型HPV如HPV6和11等，主要引起皮肤和粘膜的良性肿瘤，如皮肤疣，寻常疣，生殖疣等。高危型如HPV16和18等，主要引起恶性肿瘤如宫颈癌、喉癌、肺癌、口腔癌等。根据分子流行病学研究的结果，HPV16是我国妇女宫颈癌的主要型别［4］。有关HPV癌基因E6，E7的研究已有很多，如E6主要在人的乳房细胞中有活性，E7主要在人和啮齿类的细胞中有活性等［5，6］。但由于该病毒不能在体外进行培养，妨碍了病毒自然感染历史和装配的研究。对于主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2的研究，目前国内外许多实验室试图用原核系统或真系统表达L1和L2，据推测，真核系统表达的蛋白经过翻译后修饰，形成病毒样颗粒(VLP)，其活性更接近于相应的天然蛋白。但是无论原核或真核系统表达的蛋白，其高产量一直是关键的问题。我们利用原核表达载体pET-30a获得了L1和L2的高效表达菌株。 1 材料和方法1.1 材料来源 pET-30a载体和BL21菌株由中国医学科学院基础医学研究所生化室赠送；pUC18-L1, pUC18-L2质粒由中国预防医学科学院病毒所遗传室赠送；1 kb DNA ladder为GIBCO BRL公司产品；限制性内切酶Bg1Ⅱ、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶，蛋白中相对分子质量标准品为美国Promega公司产品；KpnⅠ为华美公司产品；DH5α为肿瘤研究所保存；Penta-His Ab为德国Qiagen公司产品；GaM-HRP为美国Jackson公司产品。
1.2 质粒构建 HPV16 L1和L2 ORF克隆到pET30a载体的方法如下：pUC18-L1和pUC18-L2分别用Bg1Ⅱ酶切后，用DEAE-纤维素法回收纯净化，pET30a载体用BamHⅠ酶切后，用同样的方法回收纯净化，然后在T4连接酶作用下，将L1(nt 5 637-nt 7 151)和L2(nt 4 138-nt 5 668)分别克隆到pET-30a的BamHⅠ位点，克隆的结果经酶切鉴定正插方向。pET30a-L1用EcoRⅠ酶切，pET30a-L2用KpnⅠ酶切鉴定。
1.3 L1和L2融合蛋白的表达 pET30a-L1和pET30a-L2质粒经过42℃90 s，分别转入感受态的BL21菌中，含该质粒的菌在37℃生长至对数中期，(A600 nm=0.6)，加入IPTG使终浓度为1 mmol/L, 诱导3 h冰浴5 min; 5 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清，菌体用1/10体积50 mmol/L Tris(pH8.0), 2 mmol/L EDTA重悬，加入溶菌酶(500 μg/ml)和1% TritonX-100(1%体积)，30℃15 min; 12 000 r/min 4℃离心15 min, 弃上清，沉淀中加入1/50体积50 mmol/L Tris(pH8.0), 2 mmol/LEDTA重悬，进行L1和L2蛋白检测。
