医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:50

【摘要】 目的 分析中国丙型肝炎病毒非结构基因5 b区核苷酸序列变异。方法 以逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)从49例中国病人的血清中获得互补的DNA片段，产物克隆后测序。结果 33株系基因Ⅱ/1 b型，16株系Ⅲ/2 a型，中国HCV株型与日本HCV株型同属1个基因亚型，但在一些核苷酸保守位点上有一定的差异，对33株Ⅱ/1 b型和16株Ⅲ/2 a型间的同源性进行比较，发现16株Ⅲ/2 a型的同源性低于33株Ⅱ/1 b型的同源性。首次在HCV NS 5 b区发现1个新的3个核苷酸的缺失突变及1个移码突变。结论 同一基因亚型之内不同HCV株的核苷酸序列可能具有一定的地理分布特征，每个地区有一定的流行株。 Variation of primary structure in nonstructural region 5 b of hepatitis C virus

WEI Lai^*, WANG Yu, CHEN Hongsong, et al.

(The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, 221002)

【Abstract】 Objective To analyze the sequence variation in the nonstructural region 5 b(NS5 b) of hepatitis C virus (HCV) of China.Methods Complementary DNA fragments from sera of 49 Chinese patients were amplified by reverse transcription nested polymerase chain reaction (RT-nested-PCR) and the products were cloned and sequenced.Results 33 clones belonged to genotype 1 b and 16 clones were genotype 2 a. Several conserved nucleotide sites were found to be different from those of Japanese isolates though they belonged to an identical genotype. Comparison of average homology among the 33 clones of genotype 1 b and the 16 clones of genotype 2 a indicated that the average homology among genotype 2 a was lower than that among genotype 1 b. A deletion of three nucleotides and a frame-shift, resulting from the introduction of an in-frame stop codon, were firstly observed in the NS5 b region.Conclusion The nucleotide sequences of different HCV isolates of a same subtype may possibly possess the characteristics for different geographical distribution and so a definite epidemic HCV strain may emerge from a definite area. 【Key words】 Hepatitis C virus Non-structrual gene variation Sequence analysis 对HCV基因组一级结构的研究是进一步了解HCV病原学特征，设计有效合理的HCV感染诊断试剂及观察HCV分子生物学特征与感染和治疗关系的基础。目前关于Ⅱ/1 b型HCV基因组的序列已有较多报道，关于中国人感染的Ⅱ/1 b型HCV一级结构也有两篇报道^［1，2］。而Ⅲ/2 a型HCV的全序列全世界至今只发现了一株^［3］，关于Ⅲ/2 a型HCV部分基因区序列的报道也极少。为此，本组实验对33例Ⅱ/1 b型HCV感染者的33个克隆，16例Ⅲ/2 a型HCV感染者的16个克隆作NS 5 b区的序列分析，初步了解中国HCVⅡ/1 b与Ⅲ/2 a型的部分基因区一级结构变异情况。 1 材料和方法 1.1 血清标本 随机选择抗-HCV抗体阳性(第2代EIA试剂，北京医科大学肝病研究所)，5′UTR与NS5区的HCV RNA PCR均阳性的33例Ⅱ/1 b型与16例Ⅲ/2 a型的HCV感染者。所有感染者均为北京医科大学人民医院肝炎门诊就诊患者。 1.2 NS5 b区cDNA的PCR扩增与克隆 以异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取HCV RNA^［4］。参照HC-C2^［1］与HCV-J^［5］的序列设计2对引物(外引物，5′-GAGTTCCTGGTGAATACCTG-3′和5′-GATGTTATCAGCTCCAGGTC-3′；内引物，5′-GCTGAATTCGACACCCGCTGTTTTG-3′和5′-CAGAAGCTTAGTCATAGCCTCCGTG-3′，下划线为限制性内切酶位点)，从患者血清中扩增出HCV NS5 b基因，经限制性内切酶EcoRⅠ与HindⅢ消化后克隆于pUC18的相应位点中。 1.3 HCV NS5 b区基因的核苷酸序列测定 以限制性酶切长度多态性分析及PCR方法鉴定阳性克隆，以pUC18/M13通用引物为测序引物，采用Promega公司fmol DNA测序试剂盒，³²P(北京亚辉公司)引物末端标记，测定重组子序列。每个克隆正向测2次，反向测1次，以确定所测序列的准确性。具体操作按试剂盒要求。 2 结果

2.1 49个中国株HCV NS5 b区部分基因的一级结构及与日本株的比较 本组实验共获得49个克隆，其中Ⅱ/1 b型33个克隆，Ⅲ/2 a型16个克隆。所测定的核苷酸序列及相互比较见图1，2(GeneBank登录号为AF 046161～AF 046209)。由图1可见，33株Ⅱ/1 b型HCV在NS5 b区的第7 964，7 971，8 010，8 021，8 044，8 067，8 070，8 130，8 133，8 158，8 178，8 235，8 238，8 263，8 264及8 273位核苷酸HCV-1位置，与日本株HCV-J不同而与中国株HC-C2相同，33株间也基本相同。由图2可见，16株Ⅲ/2 a型HCV中，此区域核苷酸的第7 962，7 989，8 046，8 154，8 158，8 185，8 214，8 237及8 247位与日本株HC-J6不同，而16株中国株之间基本相同，揭示以上位点可能为中国株的相对保守位点。

责任编辑: 参与评论