甘草甜素，环孢霉素A和肿瘤坏死因子α对U-937细胞和MRC－5细胞中巨细胞病毒感染的作用
摘要：机体免疫功能受抑制时，单核细胞或巨噬细胞内潜伏的或持续存在的人类巨细胞病毒（HCMV）感染会重新激活。我们研究了甘草甜素，环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α对U-９３７细胞和MRC－５细胞中感染的人类巨细胞病毒（HCMV）的病毒DNA合成和抗原表达的作用。虽然在本研究中，根据流式细胞仪和免疫荧光分析的结果，甘草甜素对人类单核细胞系U-９３７细胞和人类胚胎肺细胞系MRC－５细胞中的人类巨细胞病毒（HCMV）的抗原表达都有抑制作用，用聚和酶链式反应方法仍可检测到超早期的人类巨细胞病毒（HCMV）DNA。环孢霉素A,和肿瘤坏死因子对U-９３７细胞和MRC－５细胞中感染的人类巨细胞病毒（HCMV）没有抑制作用。U-９３７细胞和MRC－５细胞中人类巨细胞病毒（HCMV）感染的模型不仅有助于阐明持续感染的机制，而且也有助于阐明抗人类巨细胞病毒（HCMV）的化学因子的作用机制。J.Leukoc.Biol.５５：２４－２８；１９９４。
关键词 ：巨细胞病毒，甘草甜素，U-９３７细胞，MRC－５细胞，聚和酶链式反应 引言虽然人类巨细胞病毒（HCMV）感染在人的一生中任何时候均会出现，每次感染的临床特征却各不相同。人类巨细胞病毒（HCMV）感染最常见的是引起先天的和围生期的感染，但它在输血获得性感染方面也占重要地位，在器官移植病人，接受免疫移植剂化疗的病人，接受大剂量皮质醇激素治疗的病人，或人类免疫缺陷病毒１型（HIV-1）感染的患者的发病率和死亡率方面也有举足轻重的作用〔１〕。巨细胞病毒原发感染通常是个良性的过程，但是从此病毒就会在宿主细胞中潜伏下来或持续存在。一旦宿主的免疫功能受抑制时，这些潜伏或持续的感染就会被重新激活，产生多种多样的临床表现。单核－巨噬细胞系的细胞似乎是人类巨细胞病毒（HCMV）潜伏或持续感染的主要场所〔２，３〕。但是，在体外很难使人类巨细胞病毒（HCMV）感染单核细胞和巨噬细胞。在无症状的病毒携带者的外周血细胞中，检测不到巨细胞病毒的基因表达〔４－６〕。我们成功地使该病毒的AD１６９株感染了人类单核细胞系U-９３７细胞，并获得了一个人类巨细胞病毒（HCMV）的临床分离株〔７〕。为了研究抗巨细胞病毒因子对人类巨细胞病毒（HCMV）感染的U-９３７细胞中病毒重新激活的抑制作用。因此，我们研究了甘草甜素，环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α对U-９３７细胞和MRC－５细胞中感染的人类巨细胞病毒（HCMV）的病毒DNA合成和抗原表达的作用。
缩写：ATCC，American Type Culture Collection；CMV 巨细胞病毒；CsA 环孢霉素A；EA 早期抗原；GL甘草甜素；HCMV 人类巨细胞病毒；HIV-1 ，人类免疫缺陷病毒１型；HLA,人类白细胞抗原；IEA，超早期抗原；IFA，免疫荧光分析；IgG，免疫球蛋白G；LA晚期抗原；mAb，单克隆抗体；MOI，多重感染指数；PBS，磷酸盐缓冲液；PCR，聚和酶链式反应；PKC，蛋白激酶C；TNF-α,肿瘤坏死因子-α；VZA，水痘－带状疱疹病毒
重印许可：日本，Hokkaido,Sapporo 医科大学，临床医学院，儿科系
材料和方法 细胞系和人类巨细胞病毒（HCMV）的扩增：U-９３７细胞单核细胞系是从美国类型培养样品库（American Type Culture Collection,ATCC）获得的，并于加有１０％加热灭活的胎牛血清、２mM左旋谷氨酸、２５０U/ml青霉素和２５０ug/ml链霉素的RPMI１６４０培养基（Gibco产品）制成悬浮液（２x１０５到２x１０６）。整个实验使用的都是从ATCC获得的人类巨细胞病毒（HCMV）的AD１
６９实验室株。这一病毒在人类胚胎肺细胞（MRC－５细胞）中进行扩增，采集为细胞相关的。人类巨细胞病毒（HCMV）的计数通过MRC－５细胞的噬菌斑分析而获得。为了增加感染率，我们将５x１０５U-９３７细胞用聚凝胺（２ug/ml）置于５mlRPMI培养基中预处理２０分钟。然后将细胞进行离心分离，并重新悬浮于0.5ml无细胞的AD１６９病毒株中以1.0的多重感染指数（MOI）维持三小时。然后将细胞进行再次离心，以除去未结合的病毒，用新鲜培养基冲洗三遍后再次进行离心，然后再次悬浮于新鲜培养基中。在２４小时的间隔期内，细胞受到病毒攻击，并在新鲜培养基中再次悬浮。在其中的一些实验中，培养基中含有不同浓度的甘草甜素，环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α，下面将进一步解释。这样，在多种培养基中，多次进行离心和用新鲜培养基悬浮，使细胞得到清洗。0.1MOI的AD１６９株还被接种于１－打兰培养瓶中，后者带有１２毫米直径的铺有一层MRC－５细胞的盖玻片。将培养瓶在室温下以７００g进行离心，然后培育三小时，以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次以除去为结合的病毒，然后在３７℃下培育４８小时。培育后，将培养瓶用MicroTrak巨细胞病毒培育鉴定试剂染色（CA,Palo Alto,Syva公司生产）。感染的MRC－５细胞的比例通过间接免疫荧光分析方法（IFA）检测〔８〕。在含有甘草甜素，环孢霉素A,和肿瘤坏死因子α的培养与作为对照的（不含药物的AD１６９接种的U-９３７细胞）培养中，免疫荧光染色人类巨细胞病毒（HCMV）超早期抗原（IEA）和早期抗原（EA）阳性细胞的比例被进行了比较。
表面抗原的流式细胞仪分析：细胞表面抗原的分析是通过流式细胞仪进行分析的，使用了下列结合有荧光素的单克隆抗体（mAbs）：CD３,CD４,CD８,CD45R,Leu-15(Mac-1),Leu-Mi,HLA-DR,和免疫球蛋白G的Fc段（CA,Mountain View ,Becton Dickinson公司生产）。对每个样品都用相应的同位素特异的对照抗体进行分析。我们使用了对数－线性转换表对每个荧光色谱图与其对应的合适的荧光素标记的同位素对照（IgG1-FITC;Becton Dickinson公司生产）进行了比较。在染色过程中，使用了人类巨细胞病毒（HCMV）超早期抗原和晚期抗原的单克隆抗体（CA,Temecula,国际化工公司生产）。
药物： 甘草甜素由东京Minophagen 制药公司提供。用0.01M磷酸盐缓冲液溶解后，用１N的氢氧化钠，调节PH为７．２。本实验使用的环孢霉素A是东京Sandoz公司赠送的。肿瘤坏死因子－α是从Sigma化工公司购买的。药物对MRC－５细胞和U-９３７细胞的细胞毒性是通过对宿主细胞DNA的抑制，见前面所述〔９〕。宿主细胞DNA合成的CD５０是定义为：减少５０％的对照细胞培养中结合的〔３H〕胸腺嘧啶核苷所需的药物浓度。