医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:48

关键词: 朊病毒；prp基因；表达 【摘要】 目的 研究与人类海绵状脑病发病有关的膜蛋白PrP^c的生物学功用，同时以其为抗原建立有效的免疫学诊断方法。方法 采用PCR扩增并克隆2例中国人prp基因，经DNA序列分析后，亚克隆至GST融合蛋白表达质粒。结果 1例正常人prp基因带有点突变，导致形成终止密码，另1例prp基因序列与已发表的标准prp基因序列相同。在GST融合蛋白表达系统中，标准及突变prp基因可有效地表达完整及缺损的PrP蛋白。Western蛋白转印试验证实，所表达的GST-PrP融合蛋白具有良好的免疫反应性。结论 人prp基因能在大肠杆菌GST融合蛋白表达系统中得到高效地表达。 Expression of human prp gene in prokaryotic cells using GST fusion protein expression system ZHAO Xia, DONG Xiaoping, HUNG Tao, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine. Beijing 100052 【Abstract】 Objective To study the biological features of cell-surface protein PrP^c, which is thought to be involved in the prion-associated diseases after converting to a proteinase-resistant isoform PrP^Sc posttranslationally, and to establish an effective immunologic diagnostic method using PrP^c as antigen.Methods Amplifying and cloning the human prp gene from lymphocytes of two normal Chinese, after confirmed by DNA sequence analysis, the genes were separately subcloned into a GST-fusion expression plasmid.Results Sequence analysis showed that one contatined a point mutation that induced the 65^th amino acid “Trp” inverting to a stop codon “TAG”, whereas the other had the same sequence as the published standard prp gene.Both the standard and the mutated prp genes were separately subcloned into a GST fusion protein expression vector and expressed in the prokaryotic cells effectively. Western blot assay revealed that both of them expressed GST-PrP fusion proteins and could be recognized by PrP specific monoclonal antibody.Conclusion It suggests that human PrP protein can be expressed in the GST fusion protein expression system and the expressed proteins hold good immune-reactivity. 【Key words】 Prion prp gene Expression 人类海绵状脑病是一组传染性中枢神经系统退行性疾患，主要包括库鲁病(Kuru)，克-雅氏病(Creutzfeld-Jakcob disease, CJD), 吉-斯综合征(Gerstmann-Straussler syndrome)等，其传染及致病因子为“朊病毒”^［1，2］。目前的诊断仍主要依靠临床表现和脑电图改变。朊病毒主要的、甚至唯一的成分是33 000～35 000的糖蛋白PrP^Sc，它是正常细胞膜蛋白PrP^c在不明条件下出现的一种异构体^［3，4］。PrP^c的正常功能尚不明了。为了研究PrP^c生物学功能，同时以其为抗原建立有效的临床实验室诊断方法，我们采用聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆人prp基因，利用GST融合蛋白的表达系统，有效地表达PrP蛋白。 1 材料和方法

1.1 人外周血白细胞DNA的提取 实验所用人血液标本取自北京友谊医院。将新鲜血液按常规方法分离淋巴细胞，提取细胞DNA。

1.2 PCR 实验所用引物在中国科学院微生物学研究所合成。上游引物：5′-TGGATCCAAG

AAGCGCCCGAAGCCT-3′，下游引物：5′-TGGA

TCCTCATCATCACGATCCTCTCTGGTAAT-3′。在引物5′-端分别加有一个BamHI酶切位点。1 μg细胞DNA与100 pmol/L引物，2.5 mmol/L dNTP, 5U Taq DNA多聚酶(Promega公司产品)混匀，反应体积为100 μl。反应条件为：94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟。PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳鉴定。

1.3 质粒构建 将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。按PCR克隆试剂盒(Promega公司产品)说明，将PCR扩增产物连接至pGEM-T载体，构成质粒pGEM-T-prp(图1)。以BamHI游离pGEM-T-prp中插入的人prp片段，琼脂糖凝胶电泳纯化回收后克隆至GST融合蛋白表达载体pGEX-2T(Pharmacia公司产品)，构成质粒pGEX-prp(图1)。 图1 质粒pGEX-prp构建示意图。构建过程详见材料与方法1.1 Fig.1

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