医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:49

单位：400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所

关键词: 乙型肝炎；靶细胞；细胞免疫 【摘要】 目的 研究特异性细胞免疫反应在病毒性肝炎发生发展中的作用及观察药物等对细胞免疫反应的影响。方法 用DNA重组技术构建逆转录病毒重组质粒PLXSN-S，以电穿孔方法转入PA317细胞，筛选高表达克隆，收集其假病毒颗粒感染EL₄细胞，经有限稀释选择高表达克隆。结果 重组质粒转染PA317细胞后，53个克隆形成(1∶10传代)，在24孔板中扩增后有7个克隆细胞上清HBsAg阳性。用HBsAg A值(曾称OD值)最高克隆的假病毒感染EL4细胞，再经有限稀释得到稳定、高效表达HBsAg的靶细胞系(EL₄-S)，在体外传100代以上，HBsAg仍能高效表达(48小时上清中HBsAg的A值达0.85)。经检测PLXSN-S及重组腺病毒rAd-B_7-2-S免疫后小鼠对HBsAg特异的细胞免疫反应，得到较为满意的结果。结论 我们成功构建了稳定表达HBsAg的靶细胞，对研究HBsAg细胞免疫反应及乙肝免疫发病机理等方面有重要意义。 Production of HBV surface antigen-specific target cell

ZHOU Zhi ZHANG Dingfeng REN Hong

(The Institute for Viral Hepatitis, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010)

【Abstract】 Objective To analyze the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)-specific cytotoxic T-cell(CTL) response during hepatitis development and investigate the effect of some factors on CTL response.Methods The recombinant retrovirus plasmid PLXSN-S was tranferred into PA317 by electroporation and the pseudoviruses produced from PA317 were used to infect EL₄. Clones which highly expressed HBsAg were selected with limited dilution.Results A clone expressing-HBsAg the highest (A=0.85 in supernatant at 48th hour) was obtained which steadly expressed HBsAg in vitro after at least 100 passages. It worked very well when used as target cells in CTL response after C₅₇ mice immunized with PLXSN-S and recombinant adenovirus vector (rAdv-B_7-2-S).Conclusion We constructed HBsAg-specific target cell line which steadly expressed HBsAg. It may play an important role in HBsAg CTL reponse and immunopathogenetic mechanisms of hepatitis B. 【Key words】 Hepatitis B Target cell Cell mediated immunization 乙型肝炎病毒致慢性感染，病情持续活动，可以发展为肝硬化及肝癌。关于乙型肝炎慢性化的机理及乙肝病毒感染后肝细胞大量坏死致重型肝炎的原因尚不清楚。一般认为乙型肝炎病毒感染后并不直接破坏受染肝细胞，肝炎的发生发展被认为是由于受染细胞表达病毒抗原激发相应的免疫反应所致。由于缺乏理想的动物模型及乙肝病毒对宿主的严格限制，给乙型肝炎发病机理研究带来很大的难度。乙型肝炎病毒感染后病毒的清除主要靠CTL和CTL所释放的细胞因子^［1］。要研究HBV感染后CTL的数量和质量，以及其它因素(包括药物)对机体细胞免疫反应的影响，则需要构建稳定表达HBV各种抗原的细胞系。由于HBV在体外不能感染细胞，因此只能借助细胞转染技术。因为CTL的作用有MHC限制^［2］，所以靶细胞的MHC应与CTL的MHC完全相同才能发生作用。我们构建表达HBsAg的重组逆转录病毒载体，用之转染PA317，然后筛选高表达克隆，用其假病毒颗粒感染C57小鼠淋巴瘤细胞系EL4，经有限稀释获得高表达克隆EL4-S，体外连续传100代以上，HBsAg仍能高效稳定表达，在PLXSN-S及重组腺病毒载体radv-B_7-2-S免疫的C57小鼠CTL反应中取得满意结果。现报道如下： 1 材料和方法 1.1 质粒、菌株及细胞 PLXSN为逆转录病毒载体，基本骨架来自PBR322，含SV40启动子，控制G418抗性基因的表达，插入的外源基因表达受逆转录病毒LTR中启动子控制，购于第三军医大学分子生物学教研室；受体菌RR₁本所保存，PBKS⁺-S任红教授提供，PA317、NIH3T₃、EL₄细胞系购于上海细胞生物研究所。 1.2 工具酶 EcoRⅠ、BamHⅠ、T₄DNA连接酶购于Promega公司，Polybrene Sigma产品，Taq DNA聚合酶、质粒回收试剂盒够于上海华顺公司，中量提取试剂盒Qiagen公司产品。 1.3 RNA抽提试剂盒、逆转录PCR试剂盒购于BOEHRINGERMANNHEIM公司，操作按说明书进行。 1.4 电穿孔仪 Gene Pulser^{R ○}Ⅱ Electroporation System(BIO-ARD)。 1.5 其他试剂

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