医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:49

关键词: GBV-C/HGV；大肠杆菌；基因表达；抗原性分析 【摘要】 目的 研究HGV NS3区基因产物的抗原性，并探讨NS3蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株HGV NE3区的3个基因片段分别克隆到pRSET B和pRSET C 质粒载体中，构建成原核表达载体。IPTG诱导下，在大肠杆菌BL21中高效表达，获得3 个重组蛋白，用Western blot和ELISA法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达，得到的重组蛋白PA、P3和P4的分子量分别为42 000，30 000和24 000，在Western blot和ELISA反应中均可被HGV阳性血清识别，其中HGV NS3区N端的基因产物抗原性较强。结论 中国株HGV NS3区的N端存在优势的抗原决定簇，其基因产物有较好的抗原性。 Expression of non-structural region 3 gene of the Chinese HGV and analysis of the antigenicity of the recombinant proteins CHEN Gang, BI Shengli, ZHAN Meiyun. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine 100052 【Abstract】 Objective This study is to analyze the antigenicity of the NS3 proteins of Chinese HGV and their potential use in the serological diagnosis.Methods All three gene fragments of NS3 region of Chinese HGV were cloned into the pRSET vectors to construct recombinant plasmids. In E.coli BL21, all three recombinant plasmids achieved a high expression level with induction of IPTG. The expressed products were analyzed with Western blot and ELISA. Results The recombinant protein PA, P3 and P4 have a molecular weight of 42 000, 30 000 and 24 000, respectively. They all could react with HGV positive sera in Western blot and ELISA. Among them, the protein that covers the N terminal of NS3 region of HGV had a stronger reaction with HGV positive sera than the other two proteinsdid.Conclusion The N terminal in the NS3 region of Chinese HGV includes an dominant antigenic determinant, and its gene product has relatively strong antigenicity. 【Key words】 GBV-C/HGV E.coli Gene expression Antigenicity GBV-C/HGV是1995年由Simons^［1］、Linnen等^［2］相继报道的一种新的经肠道外途径传播的病毒，它与HCV同属于黄病毒科。其基因组全长约9.4 kb，由单一的读码框架编码约2 900个氨基酸的多聚前体蛋白。目前研究证明，庚型肝炎病毒的感染在全球都存在，我国健康人群和临床型肝炎病人中也检出了HGV RNA。在实验室诊断方面，除了依靠RT-PCR检测病毒RNA外，还有以CHO细胞表达的E2蛋白为抗原，用ELISA方法^［3，4］检测血清中的病毒抗体。但是，当病人血清中的抗E2抗体为阳性时，病毒RNA往往已经阴转，故抗E2抗体可作为病毒清除的一个标志^［5］，或者是既往感染的一项指标。然而，由非结构蛋白诱发产生的抗体往往与RNA同时存在，因此可考虑作为临床诊断病毒感染的一项指标。鉴于GBV-C/HGV NS3区存在优势抗原表位^［6］，该区段基因的表达产物可能有较好的抗原性，我们将已克隆到的河南株GBV-C/HGV NS3区不同基因片段在大肠杆菌中进行了高效表达。对表达产物的抗原性分析发现，NS3区N端1/3的基因产物可以被GBV-C/HGV阳性血清较好地识别。 1 材料和方法

1.1 质粒和菌株 GBV-C/HGV NS3区基因，为本室从河南1份GBV-C/HGV RNA阳性血清中经RT-PCR扩增并克隆到pcDNAⅡ质粒载体中的^［7］。表达载体为pRSET B和pRSET C(Clontech公司)，由厦门大学生物系夏宁邵教授惠赠。大肠杆菌DH5α和BL21由本室保存。

1.2 HGV C区合成肽 根据中国河北株HGV序列^［8］，由本室设计，赛百胜公司合成(具体序列尚未发表)。

1.3 GBV-C/HGV NS3区基因原核表达质粒的构建 用常规PCR方法从克隆载体中分别扩增NS3区的3个片段，即FA(nt3 073-4 416)、F3(nt4 316-4 762)和F4(nt4 753-5 188), 所用引物序列见表1。将片段FA用BamHI和SmaI双酶切，得到的1.0 kb克隆入pRSET B 质粒载体的BamH Ⅰ和PvuⅡ位点之间；将F3和F4分别用Klenow酶补平末端后用BamHⅠ酶切处理，然后克隆入pRSET C质粒载体的BamHⅠ和PvuⅡ位点。连接产物转化大肠杆菌DH5α后，快提质粒酶切鉴定，得到含有插入片段的重组质粒。

表1 扩增GBV-C/HGV NS3区基因片段所用的引物 Tab.1 Primers used for amplifying gene fragments in NS3 region of GBV-C/HGV

引物 Primer	位置(nt) Position	序列(5′—3′) Sequence
EF1	3 073-3 092	CATTCACTAGGACGGACTGT
3R2	4 430-4 416	GCCTCTAGAGATGATGGAACTGTC
3F3	4 316-4 335	CAGGATCCTCGTATTCTGCC
3R3	4 762-4 742	AGGCTAGCTGTCAGATCAGGT
3F4	4 753-4 772	CAGGGATCCTTCTGAGACTA
3R4	5 188-5 168	ACTCTAGACCCGGTGTATGAG

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