医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:50

【 摘要 】 目的 研究猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)LTR区SF2或SF3位点结构与病毒转录活性的关系。方法 利用LTR5端引物和含SF2或SF3部位双点突变的中间引物，首次用PCR扩增长度约0.6kb的SIVmac239 LTR 5端DNA片段，经纯化后，作为正向引物，再次用PCR扩增长度约1.1kb的LTR全段(9 209～10 279)并将其连接到PBS-SIVmac239 3端病毒的重组质粒上，后者再经SphⅠ切点与SIVmac239 5端病毒连接。用突变的病毒转染外周血淋巴细胞(PBL)，用ELISA法动态测定培养液中SIV核心蛋白P27浓度。结果 与SIVmac239株相比，SF2或SF3突变株在转染后，其核心蛋白P27水平无明显降低。结论 两步PCR诱导突变是一种简单有效的方法；SF2或SF3位点结构对于SIVmac239在外周血淋巴细胞中的转录活性可能不具重要的影响。 PCR-based mutagenesis on SF2 or SF3 site and transfection study with SIV mutants LIU Xiaomin^*, ZHANG Qiubin, PAN Shangha, et al. ^* Laboratory of Molecular Biology, First Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001 【 Abstract 】 Objective To study the relationship between the structure of SF2 or SF3 site in LTR of SIVmac 239 clone and the viral transcription ability.Methods About 0.6kb DNA fragments of SIVmac 239 LTR 5 terminal were separately amplified by first step PCR together with 5 outside primer and the middle primer containing two point mutations on SF2 or SF3 site. Following purification, as a forward primer, the amplified fragments were used in the second PCR run, and an 1.1kb fragment from SacI (9 209) to the end (10 279) of LTR was produced and cloned into PBS-SIVmac 239-3 recombinant, then ligated with PBS-SIVmac 239-5 recombinant. The peripheral blood lymphocytes (PBL) were transfected by the mutants and the concentration of SIV core protein P27 in cultured medium was monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results No significant change was found in the replicating ability of SIV mutants compared with original SIVmac 239 clone.Conclusions The results indicate that two step PCR is a simple and efficient method for mutagenesis in vitro; the SF2 or SF3 site may be not necessary for efficient replication of SIVmac 239 clone in PBL. 【 Subject words 】 Simian immunodeficiency virus PCR Mutation Transfection 猴免疫缺陷病毒(SIV)是一组与人类免疫缺陷病毒(HIV)相关的灵长类隐性病毒，从恒河猴外周血中分离的病毒称为SIVmac。SIVmac239等致病株感染的猴表现出与人类AIDS相似的疾病^〔1，2〕 ，SIV感染人类也有报道^〔3〕。SIV基因组中长末端重复区(Long Terminal Repeat,LTR)参与对病毒转录活性的调节，在该基因的U3区域存在着一组可与相应转录因子结合并相互作用的部位，包括核因子NF-KB位点和位于其毗邻5＇上游区的几个SF(Simian Fator)位点，如SF2和SF3，形成了特定的顺式作用元件(Cis-acting element)，影响病毒的转录活性^〔4，5〕 。为了解LTR区SF2或SF3部位的结构与NF-KB或病毒转录活性的关系，采用两步PCR法诱导突变，建立了携带LTR区SF2或SF3处双碱基突变的SIVmac239突变克隆并进行了体外转染研究。 材料与方法 1.主要试剂： PBS-SIVmac239病毒克隆(P239-5＇,P239-3＇)由新英格兰地区灵长目研究中心提供，Geneclean kit购于Bio101公司(Lajolla,calif)，PBSK质粒、Pfu Taq聚合酶和感受态细胞(E.coli HB101)均为Stratagene公司产品，DNA测序试剂盒为USB公司产品，³⁵ S α-dATP为Amershan公司产品，SIV核心抗原P27酶联免疫试剂盒由美国马里兰大学免疫系赠送。 2.PCR诱变

(1)引物设计：根据SIVmac239 LTR区的核苷酸序列，合成5条引物，包括：LTR 5＇端正向引物(Pfor)，内含SacⅠ切点(9230)；LTR 3＇端反向引物(Prev)，引物的5＇端含XbaⅠ切点；含SF2部位双突变碱基(AA)的一条中间引物(PsF2)；携带SF3部位双突变碱基(TT)的另一中间引物(PsF3)；引物P5用于序列分析。各引物序列如下。

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