RT-PCR法观察光化学法损伤VSV核酸的动态变化
Niu Hua,Sun Ping,Zhou Xipeng
(Institute of Transfusion,Beijing 100850)
【Abstract】 Objective：To understand the dynamic change in nucleic acid of VSV(vesicular stomatitis virus)in inactivating the virus by photochemistry.Methods:The nucleic acid of VSV was detected using a pair of primers originated from the gene of VSV nucleic env protein.Results:The maximal sensitivity of RT-PCR method for VSV detection was 1.8Lg TCID50.In the process of photochemical inactivation of VSV,the amount of RT-PCR product had varied at five time intervals of inactivation and decreased as the time of inactivation extended.Conclusion:The degree of VSV nucleic acid damage caused by photochemical method increases as the time of inactivation extend.
【Key words】 RT-PCR;Vesicular stomatitis virus;Light／Methylene blue,Virus inactivation
利用光敏剂亚甲基兰(methylene blue,MB)和可见光处理血浆，可灭活血浆中的包膜病毒(如HIV［1］)和一些非包膜病毒(如SV40)。MB／可见光协同作用产生单态氧(singlet oxygen,1O2）［2］，1O2通过损伤蛋白和核酸的结构及功能而灭活病毒，可以作用于核酸链上的鸟嘌呤形成8-羟鸟嘌呤(8-oxoguanine)，引起脱嘌呤和核酸链的断裂［3，4］；也可以在蛋白质之间，蛋白质和核酸之间形成共价交联［5］。脱嘌呤、RNA链的断裂和交联将使RNA分子的逆转录、DNA分子的复制受阻。RT-PCR法是利用核酸分子的逆转录和复制来实现的，RNA链的变化将对RT-PCR的结果产生影响。根据RT-PCR产物量的变化可以观察光化学法对水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)核酸的损伤程度。
1 材料与方法1.1 病毒感染滴度的测定 VSV(Indiana血清型)病毒原液(中国药品和生物制品检定所)用MEM培养液10倍稀释成10个稀释度，每个稀释度取0.1ml接种微孔板培养的Vero细胞，37℃，5%CO2条件下培养72h，观察细胞病变。根据Muench方法［6］，计算VSV感染滴度。
1.2 RT-PCR扩增VSV核衣壳蛋白基因片段
1.2.1 VSV RNA的提取 参照Chomczynski［7］方法进行：0.1ml病毒原液加入到1ml变性液中，室温放置5min，加入0.2ml氯仿，离心取上层液相，加等体积的异丙醇冷冻沉淀，70%乙醇洗涤1次，溶于12μl DEPC处理的水中，作为RT-PCR扩增的模板。
1.2.2 RT-PCR扩增 在20μl反应体系中进行逆转录，此反应体系包括：1×M-MuLV Buffer,200 U M-MuLV,1mmol/L dNTPs,1.6μg随机引物和5μl VSV RNA；37℃逆转录1h。95℃ 5min灭活M-MuLV，取3μl作为PCR扩增的模板，利用1对来源于VSV核衣壳蛋白基因的引物P1(5’-ACG GCG TAC TTC CAG ATG G-3’，位于VSV核衣壳蛋白基因编码区341～359碱基处)和P2(5’-CTC GGT TCA AGA TCC AGG T-3’，位于VSV核衣壳蛋白基因编码区739～757碱基处)进行PCR反应，引物由军事医学科学院微生物和流行病研究所合成。50μl反应体系中包括：1×PCR Buffer,2U TaqDNA聚合酶，100μmol/L dNTPs，3μl 逆转录产物，P1和P2分别为0.4μmol/L。扩增条件：94℃变性60s，72℃延伸70s，55℃复性60s,35个循环。
1.3 限制性核酸内切酶酶切鉴定扩增产物的特异性 等体积氯仿抽提PCR扩增产物去除液体石蜡：在26μl PCR扩增产物中加入3 μl 10Buffer B,20 U Hinf I,37℃过夜消化。取15μl酶切产物电泳。
1.4 RT-PCR方法检测血浆中VSV的敏感性 VSV原液用牛血浆10倍稀释成10个稀释度，每个稀释度取0.1ml作为RT-PCR扩增样品。RNA的提取和目的片段的扩增参见方法1.2，以未加VSV的牛血清RNA提取物作为阴性对照。
1.5 RT-PCR法检测VSV核酸在光灭活过程中的动态变化 将15ml VSV原液加入85ml牛血浆中，混匀，再加入MB使其终浓度为0.3μg/ml，在45000Lux灯下分别照射0、15、30、60和120min，分别从5个灭活时间段取0.1ml的牛血浆作为RT-PCR扩增的样品。
2 结果2.1 VSV感染滴度的测度 0.1ml VSV原液经系列稀释后接种Vero细胞，72h培养后，测定其感染滴度为7.8Lg TCID50。
