Ras/NF-IL-6信号转导途径介导人骨髓瘤细胞KM-3中的IL-6生物学效应

【 摘要 】 目的 研究人骨髓瘤细胞KM-3中的IL-6信号转导途径与生物学效应之间的关系。 方法 分别采用MTT、凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、免疫沉淀方法检测IL-6对KM-3细胞生长状态的影响、参与IL-6信号传递功能的转录因子以及蛋白激酶在KM-3细胞中的诱导激活状态。 结果 IL-6可明显促进KM-3细胞增殖，并可引发Ras/NF-IL-6信号转导途径活化，但Jak/STAT信号途径没有激活。 结论 Ras/NF-IL-6信号转导途径介导了IL-6对KM-3细胞的生长促进作用。 The biological function of IL-6 on a human multiple myeloma cell-KM-3 is mediated by Ras/NF-IL-6 signal transduction pathway

SONG Lun, SHEN Beifen.

（Institute of Basic Medical Science, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, P. R. China）

【 Abstract 】 Objective To investigate the relationship between the IL-6 signal transduction pathways and its biological function on a human multiple myeloma cell line-KM-3. Methods MTT, EMSA and immunoprecipitation were used respectively to detect the effect of IL-6 on the growth of KM-3 cell, the activation of transcription factors and protein kinase in the two IL-6 signal transduction pathways by IL-6 in the same cells. Results IL-6 can promote the proliferation of KM-3 cells and activate one of the IL-6 signal transduction pathway-Ras/NF-IL-6; but the Jak/STAT signal transduction pathway was not activated at the same conditions. Conclusion The biological function of IL-6 on the KM-3 cells is mediated by Ras/NF-IL-6 signal transduction pathway.

【 Subject words 】 IL-6; Multiple myeloma; Signal transduction; Biological function

白细胞介素6（IL-6）是一种多功能的细胞因子，在不同类型的靶细胞上可以体现出多种不同的生物学效应。目前的研究结果认为：IL-6在各种靶细胞中的信号转导途径主要有两条，Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径，而且它们可能分别介导IL-6的各种不同的生物学功能^〔1〕。

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种晚期B细胞肿瘤，而IL-6是维持MM细胞生存和促进其生长的一种最重要的细胞因子^〔2〕。我们以一株具有IL-6增殖反应性的MM细胞系——KM-3作为靶细胞，研究了IL-6促进MM细胞增殖过程中所涉及的信号转导机制。

主要试剂：重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所提供；α-³²P-dATP购自北京福瑞公司；用于EMSA实验的寡核苷酸引物由本室合成（OPC柱纯化）；PD98059购自Biolabs公司。抗ERK多克隆抗体和抗Jak1多克隆抗体购自SantaCruz公司；抗磷酸酪氨酸抗体PY20购自Transduction Laboratory。

细胞系：人骨髓瘤细胞系KM-3由第二军医大学侯健教授提供，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养。

MTT方法检测IL-6对KM-3细胞生长状态的影响：将传代培养的KM-3细胞于无血清1640培养基中饥饿12～16h，然后以2.5×10⁴个/ml的浓度接种入96孔板（每孔100μl），并以每孔200μl为终体积补加梯度稀释的IL-6和含10%牛血清的1640培养基，72h后加入MTT（5mg/ml，每孔15μl），代谢4～6h后加入酸性SDS溶液溶解过夜并于570nm处测定光吸收值。

细胞核蛋白提取和凝胶阻滞电泳：参见文献〔3〕。DNA探针为分别能够与STAT3结合的APRE、与NF-IL-6结合的NF-IL-6/ATF。

免疫沉淀：取KM-3细胞5×10⁶ ～1×10⁷个为一个样品，细胞预处理及刺激同核蛋白提取^〔3〕。在刺激后的每一个细胞样品中加入0.25～ 0.5 ml的细胞裂解缓冲液（50mmol/L Tris-Cl，pH7.5，150mmol/L NaCl，1% NP40，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L EGTA；临用前补加1mmol/L Na₃VO₄、10mmol/L NaF、2mmol/L PMSF和10μg/ml aprotinin，pepstin，leupep）冰浴作用30min后，12000×g离心20min，弃沉淀，上清即为细胞裂解蛋白。在以上每份蛋白产物中加入抗ERK（或抗Jak1）抗体4μg，4℃作用2h，再加入prA-agarose珠（Gibco）20μl，4℃作用4h或过夜。在进行电泳前将agarose珠用洗涤缓冲液（除NP40浓度降至0.1%以外，其余成分同以上裂解缓冲液）和PBS溶液各洗3遍，然后进行10% SDS-PAGE，按常规方法转印，并分别用抗ERK（或抗Jak1）和抗磷酸酪氨酸抗体PY20进行识别，用AP标记的二抗及其底物BCIP、NBT显色。

表达质粒转染KM-3细胞：采用Gibco公司Lipofactamine转染试剂并按其产品说明书方法进行。

1.IL-6促进KM-3细胞增殖：图1显示MTT结果，在0.001～10ng/ml的范围内，随着IL-6刺激浓度的增加，KM-3细胞的增殖效应明显增强。提示KM-3细胞对IL-6具有一定的剂量-效应增殖反应性。