医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:49

单位：200032 上海医科大学医学分子病毒学卫生部重点实验室(张蕾青 何丽芳 姚忻 闻玉梅)；上海第二医科大学瑞金医院传染科(周秋霞)

关键词: 外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；前S/S基因；基因变异 【摘要】 目的 研究外周血单个核细胞(PBMC)中乙型肝炎病毒(HBV)包膜抗原基因变异的意义。方法 收集19例慢性乙肝患者的PBMC和配对血清，用PCR扩增PBMC及血清中HBV包膜基因片段(S，preS1，preS2)，并对其中各5例PBMC及配对血清中的preS1和preS2基因片段，分别进行核苷酸序列分析。结果 S、preS1和preS2片段在血清和PBMC中的检出率，分别为100%、94.7%、100%和0、26.3%、26.3%。与HBV ADR序列比较，10份标本HBV DNA核苷酸序列分析，发现2份preS1和3份preS2的核苷酸序列，没有发生改变；8份preS1和7份preS2的核苷酸序列，均发生了一个至多个位点的点突变。结论 PBMC中存在的包膜基因不完整，因而不会形成完整的HBV病毒颗粒，故不支持HBV可潜伏于PBMC并发展成为体内HBV再感染的来源。preS1点突变编码的氨基酸位点，集中在aa21～47区域，可能会影响HBV的吸附和穿入，及组织亲嗜性的改变。HBV亚基因片段在PBMC中，是否会影响细胞的功能，有待进一步研究。 Study on HBV preS/S gene mutation in peripheral blood monouclear cells ZHANG Leiqing, HE Lifang, YAO Xing, et al. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032 【Abstract】 Objective To study the significance of mutations of HBV preS and S genes in peripheral blood mononuclear cells (PBMC).Methods Srea and PBMCs of 19 chronic hepatitis B patients were collected. The S, preS1 and preS2 gene fragments of HBV were separately amplified by PCR, and 5 cases of preS1 and preS2 gene fragments in paired sera and PBMC were sequenced.Results The positive rates of S, preS1 and preS2 gene fragments in serum and PBMC were 100%, 94.7%, 100% and 0,26.3%, 26.3% respectively. Sequence analysis of preS1 and preS2 genes showed that in 8/10 specimens there were point mutations in preS1 and 7/10 mutations in preS2; while in the others (2 of preS1 and 3 of preS2) the sequences were identical to that of wild-type HBV.Conclusion No full-length HBV genome in PBMC was detected by PCR, this is a fact not supporting that HBV can replicate, assemble and release from PBMC. The amino acid changes predicted mutatieds from nucleotide were focused in aa21-47 region, which might affect adsorption and penetration of HBV, and alteration in tissue tropism. Whether the presence of HBV subgenomic fragments in PBMC can affect cell function should be pursued. 【Key words】 Peripheral blood mononuclear cell(PBMC) Hepatitis B virus PreS/S gene Mutation 在多种病毒持续性感染中，PBMC是病毒持续存在的重要场所。国内外对HBV在PBMC中的存在状态及意义的研究十分活跃，但结果各异。有报道显示，PBMC中所检出的HBV DNA是血浆中的病毒吸附于PBMC上，并非是在PBMC中复制的HBV^［1］。也有研究证明，HBV可以在PBMC中复制产生有感染性的子代病毒，造成机体免疫功能紊乱，与HBV在体内持续有关^［2］。然而未见对PBMC中HBV亚基因片段作分析的报道。HBV的包膜抗原除能诱导机体产生中和性抗体外，其中的前S(preS)蛋白可与细胞膜受体结合，被认为是介导病毒吸附、穿入靶细胞的配体，可决定组织亲嗜性。通过对比研究乙型肝炎患者血清及PBMC中编码HBV包膜抗原基因结构的完整性和变异性，将可揭示导致HBV组织嗜性改变的可能原因，及存在于PBMC中的意义。 1 材料和方法

1.1 标本来源 住院及门诊诊断为慢性乙型肝炎患者19例。年龄12～46岁，女性4例，男性15例。其中血清HBsAg、HBeAg及抗HBc均为阳性者12例，HBsAg及HBeAg阳性者3例，单独HBsAg阳性者4例。收集PBMC和配对血清。

1.2 PBMC分离及DNA提取 取乙型肝炎患者肝素抗凝血7 ml，用比重1.077的聚蔗糖-泛影葡胺液分离淋巴细胞，2 500 r/min，15分钟，吸出淋巴细胞，用Hanks液将细胞洗5次，以去除可能残留的血浆HBV DNA，分别收集第5次洗液(500 μl)及细胞。按文献［3］法提取PBMC DNA，DNA溶于500 μlTE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0, 1 mmol/L EDTA)缓冲液。

1.3 血清及洗液中DNA的提取 同上法，从500 μl PBMC洗液及100 μl血清中提取DNA后，分别溶于30 μl及20 μlTE缓冲液。

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