医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:48

【摘要】 目的 研制新的流行性乙型脑炎传代细胞疫苗。方法 将流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2适应于Vero细胞，作纯化灭活疫苗，比较不同培养方法病毒在Vero细胞的增殖规律，对病毒的浓缩和纯化条件进行研究，并将所制备的疫苗按不同蛋白浓度免疫动物。结果 发现普通转瓶培养，可长时间维持病毒的高滴度。在感染病毒后，以无牛血清的培养基替代含牛血清的培养基，不仅可维持病毒的高滴度增殖，而且可多次收获，确立了应用8%PEG8000浓缩病毒液，15%～60%的蔗糖密度梯度超速离心纯化的工艺，每剂量为0.5 μg纯化疫苗的中和抗体水平，即可达到与现有商品疫苗相一致的滴度。结论 SA_14-14-2株制备的Vero细胞纯化疫苗，有望成为一种新的反应轻、效价高的疫苗。 Study on a purified and inactivated japanese encephalitis vaccine prepared on Vero cells using SA_14-14-2 attenuated virus strain YAO Zhihui, DONG Guanmu, YU Yongxin. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050 【Abstract】 Objective To develop a kind of new Japanese Encephalitis(JE) vaccine prepared on Vero cells.Methods A JE attenuated virus strain SA_14-14-2 was adapted on Vero cells for preparation of purified inactivated vaccine. Comparison of the growth curves of SA_14-14-2 in roller bottle and in spinner flask was made.After the virus inoculation and absorption on Vero cells for 2 hours, cultures were replaced with serum-free MEM, the culture supernatants were harvested on day 2,4,6 after inoculation. The virus fluids were pooled, concentrated by 8% PEG, and purified on 15%～60% sucrose density gradients. The purified virus was inactivated with 0.02% formalin.Results It showed that virus titer was higher and maintained longer in roller bottle. Mice vaccinated twicely with 0.5 μg dose of the purified inactivated vaccine induced neutralizing antibody titers equal to that of the mice vaccinated with primary hamster kidney inactivated vaccine. Conclusion This Vero cell prepared purified and inactivated JE vaccine made by SA_14-14-2 strain could be used for human as a kind of new JE vaccine. 【Key words】 Japanese encephalitis(JE) Vero cells Vaccine JE attenuated virus strain 目前，流行性乙型脑炎尚无特殊的治疗方法，免疫接种是保护易感人群的最有效的措施^［1］。我国目前主要使用的地鼠肾细胞灭活疫苗，细胞来源于地鼠，因此需大批量饲养地鼠，不但成本高，而且疫苗未经纯化，存在一定的地鼠肾细胞残留，容易引起过敏反应。Vero细胞是一种传代细胞，除无需动物外，还可进行多次收获的大规模工业化生产，现已由WHO批准应用于疫苗的生产，国外已有商品化的狂犬病疫苗和小儿麻痹疫苗，并已列入WHO的规程^［2～4］。我们将流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2适应于Vero细胞后，进行了纯化疫苗的初步研究。 1 材料和方法

1.1 细胞 Vero细胞来自美国ATCC，由我室传代保存，基础种子库为第124代，工作种子库为第130代。用于疫苗生产的代次，不超过第160代。

1.2 毒株 流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2为我们研制成功的流行性乙型脑炎减毒活疫苗用毒株^［5］，将其适应于Vero细胞后，作为纯化灭活疫苗用毒株。

1.3 病毒在Vero细胞上的培养 将病毒滴度大于10⁷的种子毒1 ml，稀释后接种于Vero细胞已长成单层的490 cm²的转瓶中，35℃吸附2小时，然后加入无血清的MEM培养液，在35℃的孵育箱中培养。测定不同时间的病毒滴度，将滴度大于10⁷的合并液用于浓缩和纯化。

1.4 病毒的浓缩和纯化 将合并后的病毒液在4℃下，以6 000 r/min离心30分钟，去除细胞碎片，然后加终浓度为8%的PEG 8000(Sigma产品)和0.375 mol/L NaCl 4℃下搅拌至完全溶化，6 000 r/min离心30分钟后，取沉淀用STE(100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH7.4)缓冲液溶解，12 000 r/min离心15分钟后，将上清加在已制备好的含有15 ml蔗糖梯度(60%，55%，50%，45%，40%，35%的蔗糖均为2 ml，15%的蔗糖为1 ml)的40 ml超速离心管中，然后用SW28转子(Beckman产品)以17 000 r/min在10℃离心18小时，收获并合并SDS-PAGE检测阳性的区段。

1.5 SDS-PAGE 应用8%～16%的丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝常规染色，脱色后干燥固定。

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