用氨基修饰的载玻片制作cDNA微阵列
摘 要： cDNA微阵列已在基因差异表达、寻找新基因等研究方面获得广泛应用，但有关cDNA微阵列的制作，目前多采用多聚赖氨酸修饰的载玻片为探针固定载体，固定效果较差。用氨基硅烷处理的载玻片为载体制作cDNA微阵列，然后考察其固定效率、检测灵敏度、稳定性、实用性等指标。结果表明，用氨基硅烷处理的载玻片具有比多聚赖氨酸更令人满意的核酸固定效率、检测灵敏度，且稳定实用。因此，用氨基硅烷修饰的载玻片为探针固定载体制作cDNA微阵列较为理想。
关键词： 微阵列 生物芯片 修饰 cDNA
学科分类号： Q781
DNA微阵列（DNA Microarray）也称DNA芯片，包括cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列。其在生命科学研究领域中的重要作用已经获得广泛的认同，并在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究、基因诊断等领域获得成功应用[1-3]。寡核苷酸微阵列的制作国外主要采用光诱导的在位合成技术[4]，也有用机器点（或喷）制的方法[5]，对于大片段的cDNA微阵列几乎都采用后一种方法来制作，只是不同实验室所用的固相支持物有所不同。早期的cDNA微阵列有许多是采用尼仑膜或硝酸纤维素膜为固相支持物，虽然用膜相对便宜，且在膜上的杂交技术较成熟，但由于液滴在膜上的扩散，制作的微阵列密度很低；同时因膜的荧光背景很高，探针多用放射性同位素标记，不仅存在放射性污染而且在基因差异表达研究时必需用两张膜，从而带来较大误差。因此对于较高密度的cDNA微阵列，固相支持物几乎都采用经修饰的载玻片，杂交时探针可用荧光标记，用激光共聚焦扫描仪检测杂交信号，对于基因差异表达研究还可采用双色荧光标记法[6]。目前国内外制作cDNA微阵列时载玻片的修饰方法多用多聚赖氨酸(poly-L-Lysine)处理[6-7]，但其对cDNA的固定效率不高。为此，我们研究了用氨基硅烷处理载玻片并用于制作cDNA微阵列的方法。
1 材料
1.1 仪器
PixSys 7500 DNA Microarray System， Cartesian Technologies Inc；ScanArray 3000激光共聚焦扫描仪， General Scanning Inc；PTC-100 PCR扩增仪， MJ Research Inc；UV-2000紫外透射分析仪，上海天能科技有限公司。
1.2 试剂和材料
3-氨丙基-三甲氧基硅烷，SIGMA公司；Cy3荧光染料，ARMASHAME公司；丙酮，分析纯，上海化学试剂有限公司；肝组织cDNA克隆样品由上海肿瘤研究所提供；λ DNA 2000 PCR扩增试剂盒，华美生物技术有限公司；载玻片（75.5×25.5×1.2 mm），上海工玻电器有限公司。多聚赖氨酸修饰的载玻片，SIGMA公司。
2 方法
2.1 载玻片的修饰
取载玻片数片，置于2mol/L NaOH的70%乙醇溶液中浸泡2h，取出后用水荡洗数次，110℃烘干并冷却至室温。将玻片置于1% 的3-氨丙基三甲氧基硅烷95%丙酮溶液中浸泡2min，取出用丙酮洗10次，110℃烘0.5h并冷至室温备用。
2.2 cDNA微阵列的制作
分别取人肝组织cDNA克隆的2099号片段（特异性克隆片段+载体）和λDNA 2000bp扩增片段（阴性对照）溶液（均为0.3μg/ml）各17μl，加入20×SSC缓冲液3μl混匀，转移至384孔板中，将板置于Cartesian Microarry的点样平台上，以2500dot/cm2的密度在处理好的载玻片上制作微阵列。将制备好的微阵列置湿盒中水化5min，取出置100 ℃平台上30s，然后面朝下置于UV透射分析仪上，以功率为0.5mW/cm2的320nm紫外光照射18min固定。
2.3 探针的制备
采用不对称PCR方法制备Cy3标记的2099号cDNA克隆的单链探针。具体方法是：取稀释60倍的 2099号cDNA克隆溶液作为模板，以10pmol/μl 的SP6启动子序列1μl 和1/10量的T7启动子序列为引物，加10×反应缓冲液5μl ，10nmol 的dATP，dCTP，dGTP和5nmol 的dTTP，1mmol/L的Cy3-dUTP 1μl和3U Tag酶，加水调终体积为50μl。采用0.2ml的薄壁管，按94℃，5min，（94℃，40s；55℃，40s；72℃，90s）×30，72℃，5min的扩增程序扩增得到1900bp的单链目的条带，然后用PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2%SDS缓冲液中，终浓度约为50ng/μl。
2.4 杂交
取标记好的探针溶液加至预先100 ℃煮沸30s变性的微阵列上，盖上盖玻片置于湿盒中65 ℃杂交4h，然后置2×SSC，0.1%SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1%SDS溶液中洗5min， 0.1×SSC溶液中荡洗数遍，晾干。
2.5 检测
将杂交完毕晾干的cDNA微阵列用ScanArray3000激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。
3 结果与讨论
3.1 氨基修饰的载玻片对cDNA的固定效率
用经修饰的载玻片固定cDNA分子时，固定效果可以用固定效率来评价。测定固定效率可以将带荧光（Cy3）标记的大片段核酸分子直接点在已修饰好的载玻片上，按照选定的固定条件固定，在激光共聚焦扫描仪上测定荧光强度（F1），然后模拟真实杂交条件及洗片条件处理后再测荧光强度（F2），按照：
固定效率 = F2 / F1 ×100%
计算在所选固定条件下该种载玻片对所述核酸片段的固定效率。载玻片的修饰方法不同，核酸的固定条件不同，核酸分子的大小结构等因素均会影响最终的固定效率。分别在氨基修饰和多聚赖氨酸修饰的载玻片上，以3×SSC为固定缓冲液在320nm紫外光照射下固定Cy3荧光标记的cDNA，然后测定cDNA在两种片子上的固定效率（Table 1）。经t检验，氨基修饰的载玻片对cDNA的固定效率明显高于多聚赖氨酸修饰的载玻片（P＜ 0.01）。
大片段核酸分子在氨基修饰和多聚赖氨酸修饰的载玻片上的固定主要是靠紫外照射产生多点交联，但过多的紫外照射会损伤DNA，造成DNA断裂而降低固定强度，因此紫外交联固定核酸分子存在最佳照射时间（强度）的问题。 实验表明，功率为0.5mW/cm2的320nm紫外光对cDNA的最佳紫外照射时间是18min。但在测定固定效率时，由于分布在cDNA上的荧光标记基团对紫外光的屏蔽作用，其最佳照射时间延长为30min。
3.2 cDNA微阵列的检测灵敏度
cDNA微阵列主要被用来研究基因表达等，由于许多基因表达水平很低，为了获得这些基因的表达信息，就要求cDNA微阵列的检测灵敏度较高。为此我们考察了氨基修饰的载玻片制成的cDNA微阵列的检测灵敏度，并与多聚赖氨酸修饰的载玻片制成的微阵列进行了比较，数据列入Table 2。从表中数据可知，当标记样品的浓度小至0.19ng/μl时，用后者已检测不到信号，而氨基修饰的载玻片制成的cDNA微阵列还有明显的信号，因此具有更高的灵敏度。
