含hIL-2、mIFN-γ基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体的构建

高基因治疗有效性和安全性的关键在于有效目的基因的选配和理想基因转移技术的建立。IL-2和IFN-γ是目前研究较多、疗效较为肯定的两个治疗用免疫基因，二者在诱导免疫时具协同作用。非病毒学转移方法虽具有许多优点，但转导效率低，表达时间短，提高表达效率的关键之一是改造质粒表达载体。已证实腺相关病毒反向末端重复序列（AAV-ITRs）及内含子能提高下游基因表达水平，延长表达时间。因此，我们采用亚克隆技术，在含有AAV-ITRs序列的质粒上，依次在AAV-ITRs下游装入CMVp、内含子intronA及目的基因hIL-2或mIFN-γ，构建了表达质粒pAC-hIL-2 和pAC-mIFN-γ（不含intronA）以及pAI-hIL-2和pAI-mIFN-γ（含intronA），酶切鉴定正确。体外经新型阳离子脂质体Dosper介导转染NIH3T3及MM45T.Li，于24孔板中，每孔加0.9μg DNA与3.6μl Dosper形成的复合物，培养48小时后测上清生物活性。pAC-hIL-2表达活性为324 U/ml（3T3）和152 U/ml（MM45T.Li）； pAC- mIFN- r 为1268 U/ml（3T3）和816 U/ml（MM45T.Li）；pAI-hIL-2为450 U/ml（3T3）和208U/ml（MM45T.Li）；pAI-mIFN-γ为1831 U/ml（3T3）和1625 U/ml（MM45T.Li）。由此可见，所构建质粒能有效地表达外源基因，且内含子的插入能提高基因表达水平。为下一步采用非病毒学方法进行联合基因治疗提供了新的手段。