医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:50

【 摘要 】 目的 表达iNOS N端片段并制备iNOS特异性抗体。方法 将iNOS N端片段装入原核表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL₂₁中表达，His.Bind^TM柱亲和层析分离纯化及凝胶蛋白回收的两步纯化法纯化目的蛋白，使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。结果 得到具有较高表达量的融合蛋白，经两步纯化获得iNOS N端融合蛋白纯品，将此蛋白免疫家兔，得到iNOS多克隆抗体，Western blot证实该抗体具有较好的反应性及特异性。结论 原核表达iNOS N端片段制备iNOS抗体具有很好的特异性。 Expression of iNOS N-terminal in E.coli and preparation of the specific antibody against iNOS PAN Ying ,ZHU Minsheng, SHEN Yue,et al Nanjing Military Medical Institute, Nanjing 210002 【 Abstract 】 Objective To express iNOS N-terminal fusion protein and prepare specific antibody against iNOS.Methods A fragment of iNOS(1-196AA) was inserted in pET-28a(+) plasmid and the combinant construct was transformed into BL₂₁ E.coli. The expressed protein was purified by two steps: 1. purification with a His.Bind^TM column; 2. recovery from SDS-PAGE gel . The antibody was raised by immunizing rabbits with purified protein.Results A high level expression of the target protein was found after IPTG induction and fine purified target protein was obtained by two steps purification. A polycolonal antibody was raised in the rabbit against the purified recombinant protein, Western blot analysis revealed that it did not cross-react with nNOS and eNOS.Conclusions The antibody against iNOS which was prepared by iNOS N-terminal fusion protein has good specificity and reactivity. 【 Subject words 】 iNOS Recombinant protein Specific antibody 一氧化氮（NO)及一氧化氮合酶（NOS）为近年的研究热点之一，NOS是体内合成NO的限速因素，它有三种同工酶：iNOS(诱生型）、nNOS（神经型）、eNOS（内皮细胞型）。nNOS与eNOS统称cNOS（结构型），正常生理情况下就存在于神经细胞、内皮细胞、骨骼肌、血小板等处，而iNOS必须在诱导情况下方可产生，其在细胞因子或LPS等诱导条件下表达，合成的NO是机体防御的重要因子，在微生物及免疫学上具有重要意义，其过量表达与自身免疫性疾病、败血症休克等疾病有关^〔1〕。在iNOS的研究中，特异性抗体是一重要的研究工具，国外已制备成功iNOS特异性抗体，而国内尚无这方面的报道。本实验室将iNOS N端片段进行原核表达，采用两步纯化法得到高纯度的重组蛋白，以此蛋白免疫家兔获得了高效价的特异性抗体。 材料与方法 1.质粒与菌株： pCMV/iNOS质粒（含小鼠iNOS全长cDNA)，由美国西南医学中心提供，pET-28a(+)表达质粒购自 Novagen公司，BL21菌株由本实验室保存。 2.酶和蛋白质及常用试剂： 各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自Boehinger-Mamnhein, Promega及华美公司，λ/HindⅢ分子量标准购自GIBCO-BRL公司，His.Bind^TM-sepharose购自Novagen公司，iNOS、nNOS、eNOS标准品及iNOS抗体由美国西南医学中心提供，常用化学试剂为国产或进口分析纯试剂。 3.PCR扩增、基因重组技术及Western blot分析： 按文献〔2，3〕进行。 4.重组蛋白的纯化： 按Novagen公司His.Bind^TM-sepharose树脂使用说明书进行亲和层析纯化，得到的初步纯化蛋白再以电泳回收蛋白法纯化，参考文献〔4〕进行。 5.抗体的制备及应用

制备：将1mg纯化蛋白与弗氏完全佐剂混匀，充分乳化后，皮下接种于新西兰兔足蹼，2周后同样方法加强免疫一次, 再隔一周追加免疫一次。

iNOS抗体检测TNF诱导小鼠巨噬细胞中的iNOS：小鼠腹腔注射TNF 48小时后，取腹水,分离得巨噬细胞后加入50μl缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl,pH7.4, 2mmol/L EDTA) 重悬^〔5〕，于液氮中反复冻融，离得上清进行电泳，作常规Western blot分析。

结 果 1.iNOS（1～196AA) 蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建： 以特异性引物1： 5＇-CCGAATTCATATGGCAAGCCCGTGGAAG-3＇, 引物2：5＇-GCGGATCCTCTATTAGCGATGCAGC CAG-3＇ ,以pCMV/iNOS 为模板，扩增得到约0.6kb的特异性片段，将扩增片段以 NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，电泳回收后与相同酶切的表达质粒pET-28a(+)的DNA进行连接反应，转化入BL₂₁菌株，经筛选得到重组质粒，DNA测序证明为正确重组质粒（资料未列出），命名为pET-iNOS_N196。 2.iNOS蛋白片段的表达及确证：

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