人类获得性免疫缺陷病毒Ⅰ型内壳蛋白p24在大肠埃希菌中的表达与纯化

人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)引起的^［1，2］，根据遗传学和血清学的特征，HIV可分为HIV-1和HIV-2，前者的感染遍及世界各地，后者主要局限于非洲各地^［3］。HIV基因组由9 500个核苷酸组成，在其两端是长末端重复序列(LTRs)。HIV有9个开放阅读框架，gag基因编码病毒的内壳蛋白，翻译时先形成一个55 kD的前体蛋白(p55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、p24、p15三个蛋白质。p24和p17分别构成HIV颗粒的内壳和内膜，p15进一步裂解成与病毒RNA结合的核壳蛋白p9和p7^［4～6］。在HIV感染的早期就可产生针对p24的抗体，且随着病程的进展，p24抗体滴度下降^［7］，因此p24与外膜糖蛋白一样(对于HIV-1，gp160前体的降解物外膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41；对于HIV-2，gp140的降解产物gp105和gp36)可以用来确定HIV的感染，是HIV诊断试剂盒的重要组成部分。此外，p24已被用来作为抑制病毒颗粒包装的抗病毒药物的专一靶位^［8］。为了获得大量的高纯度的p24蛋白，我们采用大肠杆菌表达载体来表达p24蛋白，并利用固定化金属离子(Ni²⁺)配体亲和层析从表达菌的可溶性蛋白中纯化了目的蛋白，为HIV诊断试剂的研制打下了良好的基础。 1 材料和方法

1.1 菌种与质粒 大肠埃希菌BL21(DE3)^［9］，在染色体上带有T7噬菌体RNA聚合酶编码基因，用于pET来源载体的表达。含有HIV-1HXB2全长基因的质粒由本室保存。

1.2 酶和试剂 pGEM-T载体系统，PCR纯化系统购自Promega公司，限制性内切酶，标准DNA，相对分子质量对照以及Taq DNA聚合酶购自宝生物工程有限公司。T4 DNA连接酶购自GIBCO BRL公司。Ni²⁺离子亲和层析填料购自Pharmacia Biotech公司。HIV阳性血清为本室保存。

1.3 p24基因的克隆与表达质粒的构建 据HXB2株基因序列，设计一对引物。引物1：5′GGCATATGCAAGGGCAAATGGT

ACA3′及引物2：5′GCCCTCGAGTGCTGTCATCATTTCT3′。扩增条件为：94℃2 min，94℃1 min，60℃2 min，72℃2 min，35个循环，72℃15 min结束扩增。扩增产物的回收纯化使用Promega公司的Wizard PCR纯化试剂盒。纯化的PCR产物与pGEM-T载体通过A-T粘端互补连接(具体操作见说明书)，通过蓝白菌落筛选挑选出白色的阳性克隆pGEM-p24，该重组质粒采用PCR，酶切及测序等方法进行鉴定。鉴定正确的质粒DNA与表达载体pET22b同时用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，用低熔点胶回收载体与p24基因片断，经T4 DNA连接酶连接构建表达质粒pET-p24。转化大肠埃希菌BL21(DE3)后，获得p24蛋白表达菌。

1.4 重组蛋白的表达与可溶性蛋白的纯化 挑单个pET-p24/BL21(DE3)克隆接种到5 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养过夜。次日以1∶100接种于500 ml同样培养基中，37℃生长到菌液吸光度A₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续诱导4 hr后离心收获菌体。-20℃冻存。菌体重悬于适量的超声缓冲液中(组成：50 mmol/L Tris. HCl, pH7.9, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 0.1% Triton X-100)冰浴下，超声破碎细菌(每次30秒，共10次。4℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清。再经4℃18 000 r/min离心30 min取上清。沉淀用适量的洗涤液(组成：50 mmol/L Tris. HCl pH7.9, 1 mmol/L EDTA, 0.1%Triton X-100， 2 mmol/L Urea)充分洗涤过夜，12 000 r/min离心20 min收集上清。上清直接过层析柱纯化(柱填料为Ni-BTA Agarose)，用平衡液洗脱至基线平，然后用含不同浓度咪唑的平衡液洗脱，收集不同的洗脱峰，用12% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，电泳完毕后将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用Western-blot检测其抗原性。其中一抗为含HIV-1抗体的血清，以1∶100稀释使用。一、二抗作用后，在二氨基联苯胺和0.01%H₂O₂溶液中显色反应，待特异性蛋白条带出现后，用蒸馏水终止反应。

2.1 HIV-1 p24基因的克隆及表达质粒的构建 以HIV-1 HXB2 cDNA为模板，采用PCR方法扩增p24基因，在引物5′端添加NdeⅠ酶切位点(含起始密码子ATG)，在3′端添加XhoⅠ酶切位点，PCR产物大小与预期的638 bp相符(图1)。扩增产物经回收纯化后，通过A-T互补粘端用T4 DNA连接酶与pGEM-T载体连接，转化宿主菌DH5α，经蓝白菌落筛选，挑选白色阳性克隆，以便于DNA酶切操作和测序，得到的重组质粒pGEM-p24经PCR扩增，酶切和序列分析证实，得到的基因克隆确系HIV-1 p24。将pGEM-p24用NdeⅠ和XhoⅠ酶切消化后，定向克隆到表达质粒pET22 b的NdeⅠ和XhoⅠ两酶切位点之间，构建重组表达质粒pET-p24(图2)。 图1 HIV-1 p24基因片段的扩增 Fig.1 Amplification of HIV-1p24 fragment 1:pBR322/BstNⅠ marker. 2:PCR product of p24. 3:Purified PCR product of p24. 4: Negative control 图2 重组表达质粒pET-p24的结构 Fig.2 Structure of recombinantexpression plasmid pET-p24 The NdeⅠ+XhoⅠ-digested 638-bp p24 fragment from pGEM-p24 was cloned in-frame up stream from a His 6 tag (p24-6xHis) in pET22b vector. PT 7: Promoter of phage T7.Ap^R:Ap-resistant marker 图3