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Caspase与Bcl-2在凋亡发生和调控中的相互作用机制

军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

胡美茹 兰雨 张学敏 沈倍奋

摘 要 Bcl-2家族与Caspase家族是凋亡发生和调控机制中两项最重要的组成部分，弄清楚二者之间的关系对进一步掌握凋亡的本质及其调控具有重要意义，其中又以Bcl-2和Caspase-3之间如何相互作用的详细生化过程最受关注，该文对此进行了综述。 关键词 ：Bcl-2蛋白；Caspase酶；细胞凋亡 Bcl-2家族与胱冬肽酶（Caspase）家族是凋亡发生和调控机制中两项最重要的组成部分，弄清楚二者之间的关系对进一步掌握凋亡的本质及其调控具有重要意义，这其中又以Bcl-2和Caspase-3之间如何相互作用的详细生化过程最受关注，是目前有关凋亡研究中最重要和最前沿的课题之一。 1 对Caspase的研究

凋亡发生机制中最关键的环节之一是Caspase的激活。Caspase可译为胱冬肽酶家族，是一组与线虫CED-3同源的调控哺乳动物细胞凋亡的蛋白酶家族^［1，2］。过去人们对凋亡研究的注意力主要集中在凋亡过程中DNA被酶切降解为寡核苷酸片段，并视其为凋亡最重要和唯一的生化指标。近年来，对凋亡研究的焦点已转移到凋亡过程中更早的一个过程，即一系列细胞内具关键作用的蛋白质被特异性酶解，而负责特异性酶切这些蛋白的胱冬肽酶家族统称为Caspase。

Caspase家族包括人IL-1β转换酶（ICE）等，现已发现14个成员^［3］。这些成员在氨基酸序列、空间结构及底物特异性上均有相似性^［4］；如体内合成时均以酶原（相对分子质量30000～50 000）形式存在，包括3个功能区:N端区、大亚单位（约20000）、小亚单位（约10 000）；被激活的过程相似，即通过功能区间特异位点的蛋白酶解，继而以大小亚单位形式形成异源二聚体。对Caspase-1及Caspase-3的晶体结构分析显示，被激活后的酶是由两个异源二聚体构成的四聚体，有两个功能独立的催化位点^［5～7］。在每个催化功能区内，大小亚基紧密连接，共同提供底物结合及催化的基团。酶原结构中有两个特征对其活化机制很重要:第一，高度变异的N端区，与活化的调控有关；第二，所有的功能区由酶原在特异位点处裂解而来，提示这些酶原的激活可能为自身催化或通过有相似特异性酶的级联反应。Caspase是最特殊的蛋白酶之一，它对底物的裂解必须在天冬氨酸之后，至少识别切割位点N端的4个氨基酸，才能发挥有效的催化作用。Caspase的四肽识别序列在不同的Caspase成员之间有很大差异，由此可解释其生物学功能的差异^［8］。这种特异性是很严格的，并非所有包含特定四肽序列者均可被切割，提示底物的三级结构可影响Caspase对底物的识别。Caspase对底物的切割不仅特异，而且高效（K_cat/K_m＞10⁶L^． mol^-1． s^-1）。Caspase-3（CPP-32/YAMA/apopain）是Caspase家族中最重要的凋亡执行者(executioner)之一,在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切（激活或灭活）。它广泛分布于各种不同类型的细胞中，其前体相对分子质量为32000,通过Asp-28-Ser29和Asp175-Ser-176两个位点酶切后而激活的Caspase-3相对分子质量为17000。

由于不断发现与凋亡有关的新的Caspase底物，所以对Caspase在凋亡中发挥作用的详细过程还不完全清楚。至今已鉴定出40多个底物，包括蛋白激酶、DNA酶、Rb蛋白以及Caspase本身等。而只有少数底物已了解它们被Caspase酶解与凋亡发生过程之间的关系^［9，10］。凋亡过程中，不同的底物蛋白被Caspase酶切后，其活性或者被激活或被灭活。Caspase通过酶解不同的底物蛋白产生不同的生物效应:（1）对凋亡抑制因子进行灭活（如CAD/ICAD^{［11，12］}）；（2）破坏细胞结构(如板层^{［13，14］})；（3）通过分离蛋白的催化及调控功能区使其获得或失去一定的功能(如凝溶胶蛋白^［15］或DNA-PKCS^［16］)，从而进一步调控相关的下游事件，如细胞皱缩、膜发疱、GSH流出、染色质聚集，导致凋亡的典型形态学改变。

Caspase特异性抑制剂DEVD-CHO、YVAD-CHO等均为竞争性抑制剂，是根据Caspase所识别的底物四肽序列特异性所设计的。它们通常能延缓与Caspase相关的凋亡进程，但不能阻止凋亡的发生。Borner等^［3］研究发现一些凋亡形态学改变如细胞皱缩、膜发疱、核浓缩等并不能被Caspase抑制剂消除。在去除EPO的红系祖细胞培养体系中，Caspase抑制剂能延缓大多数细胞凋亡的形态学特征发生过程，但无EPO培养所诱发的细胞凋亡最终仍然不可避免^［17］。Zhang等^{［18，19］}研究结果提示Caspase抑制剂部分阻止了凋亡小体的成熟和释放。

2 Caspase与Bcl-2的相互关系

Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中最主要的成员，一直被认为是细胞凋亡的抑制成分。在凋亡信号传导的过程中，通常认为Bcl-2的作用在Caspase-3激活的上游，通过抑制Caspase-3激活而发挥作用。但是对于Bcl-2和Caspase-3之间如何作用的详细生化过程还不清楚。人们发现Bcl-2蛋白抑制线粒体膜的通透性和阻止细胞色素C的释放是其中的一个主要环节。近年来对Caspase和Bcl-2之间相互作用过程的研究取得了重要进展，发现Bcl-2不仅作用在Caspase-3的上游，还是Caspase-3的直接底物。被Caspase-3特异性酶解后的Bcl-2片段，其功能发生了根本转换，从抑制凋亡变为触发凋亡。归纳Caspase和Bcl-2之间相互关系主要有以下3种情况。

（1）二者在调控凋亡过程中可以是相对独立的。如某些因素所诱发凋亡过程中的Caspase级联反应，可被Caspase特异性抑制剂所抑制，但与Bcl-2的表达水平无关。Byrd和Park等^{［20，21］}研究均发现通过转基因所致Bcl-2蛋白的过量表达并不能抑制Caspase-3的激活。反过来，Caspase-3的激活亦不会影响Bcl-2蛋白的表达水平^［20］。

（2）Bcl-2作为Caspase的上游调控机制。更多的情况下，Bcl-2的过量表达能有效地抑制住各种因素所诱发的Caspase激活和凋亡。Zhan等^［22］报道了Bcl-2可阻止具肾毒性的顺铂诱导的肾上皮细胞Caspase3的激活及凋亡。HL-60细胞经可见光照射和BDP-MA处理后发生凋亡的过程中，BDP-MA的光活化作用诱发Caspase-3和Caspase-6前体酶原酶解为有蛋白酶活性的亚单位，而Bcl-2转基因后的高表达抑制了Caspase-3和Caspase-6的激活和其他凋亡事件^［23］。获得类似结论的报道远远不限于此^{［24～26］}。Swanton等^［26］实验认为Bcl-2可抑制线粒体膜的通透性和阻止细胞色素C的释放，还通过作用于线粒体细胞色素C外释事件下游的一个关键点而先后抑制了Caspase-3和Caspase-2的激活及其Caspase-3依赖的级联反应，并使细胞免于发生凋亡。