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5. 免疫电子显微镜技术

　免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。首创此项技术的是Singer (1959)，他最先使用铁蛋白标记抗体的方法。30多年来，经过许多学者的不断改进和发展，目前用于免疫电镜的示踪物，除铁蛋白外，主要有过氧化物配和胶体金；标记物除抗体外，发展为使用葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素和亲合素、凝集素等；检测方法也由标记抗体法改进为应用双功能抗体法、搭桥法及不标记抗体的过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法等；免疫电镜技术也从最初的透射免疫电镜发展为扫描免疫电镜技术等。

5.1. 铁蛋白标记技术

铁蛋白是-种含铁23％，分子量约750kDa，直径为12-14nm的球形蛋白。其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳。在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰。通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分辨率高；但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。

5.2. 酶标记技术

Nakane和Plerce将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记抗体，通过H2O2／DAB底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位：DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过Os04处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察。而且HRP的分子量(40kDd)比铁蛋白(750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高(如铁蛋白，胶体金)。

5.3. 胶体金标记技术

1971年Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术。胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，如同铁蛋白一样具有高电子密度，在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、凝集素等结合。根据制备方法不同，可以得到直径在3-150nm之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同-标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。胶体金标记物还可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜电镜的标记物。因此，胶体金成为当前免疫电镜工作者最感兴趣的标记物。

5.4. 凝集素标记技术

凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等，凝集素(Ietin)是其总称。日前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力．如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。