脂蛋白(a)的测定方法与临床意义
| 『 摘 要 』： 脂蛋白(a)[Lp(a)] 是用免疫方法发现的一种特殊脂蛋白，结构与低密度脂蛋白(LDL)类似，但Lp(a)还含有一个特异的与纤溶酶原（PLG）具有同源性的载脂蛋白(apo)—apo(a)成份。ap(a)具有高度多态性，分子大小与血浆中Lp(a)的浓度通常成反比，高分子量表型的血清Lp(a)水平低，反之则高。大量研究发现，Lp(a)是心脑血管病的独立危险因素，其在动脉粥样硬化（AS）与血栓形成中具有重要作用。由于Lp(a)结构的特殊性，使得目前测定Lp(a)的不同方法、不同系统之间结果缺乏可比性，需对其进行标准化。本文对Lp(a)的生物化学特征、测定方法与标准化及临床意义等进行了阐述。 |
| 『 关键词 』： 脂蛋白(a) 动脉粥样硬化 冠状动脉疾病 |
1963年，北欧的挪威遗传学家Berg用受试者的人低密度脂蛋白(LDL)免疫家兔，产生一种针对LDL组分内的某种抗原成分的抗血清，Berg将这种新发现的抗原成分命名为Lp(a)。1972年， Dalhen等首先发现许多冠心病患者的血浆脂蛋白谱中有一前β-脂蛋白， 并证实该区带即为Lp(a)。1975年Dahlen等研究认为Lp(a)是AS的危险因子。1987年McLean等研究发现apo(a)与纤溶酶原(PLG)具有高度同源性，从而认为Lp(a)不仅是AS的危险因素，而且可能与纤溶系统有关。
电镜下Lp(a)呈圆球形，直径约21nm，密度为1.050~1.100g/ml，少量富含甘油三酯(TG)的Lp(a)的密度小于1.006g/ml，电泳时Lp(a)在前b与b区带之间的位置，分子量为4 600~5 600KD。Lp(a)的脂质组成和LDL相似，蛋白质部分主要由两种脂蛋白apo(a)和apoB组成，二者以二硫键相结合，通常Lp(a)分子中含1个apo(a)和1个apoB，亦可能含2个apo(a)和2个apoB。apo(a)是Lp(a)的特异性抗原，是一种高度糖化的亲水性蛋白质(含糖25%~40%)，分子量为250~800KD。apo(a)占Lp(a)蛋白总量的27-50%[ apo(a)和apoB各以一个分子计]。apo(a)肽链长度很不一致，具有高度多态性。apo(a)多态性按检测方法灵敏度可分为11~34种，基本的多态型为F、B、S1、S2、S3和S4，每个人血清含1~2种多态型。
apo(a)的氨基酸和cDNA序列与PLG具有明显的同源性，都含有Kringle结构。所谓Kringle是多态的三环结构，由三个二硫键连接而成，这种结构也见于止血与纤溶的有关其他蛋白质之中，因其形状类似于一种叫Kringle的丹麦多层蛋糕而得名。PLG含有5个富含半胱氨酸序列称为Kringle 1~5(K1~5)，K5后是一个丝氨酸蛋白酶区域，apo(a)在一个疏水性信号肽后无K1~3，有连续3~40个K4(每个K4含114个氨基酸)、1个K5和蛋白酶区域。apo(a)含有的K4结构和K5结构，与PLG同源性分别为75%~85%与85%。由于apo(a)基因结构中一个单核苷酸改变，蛋白酶区域的精氨酸取代丝氨酸，apo(a)不能被组织PLG激活剂激活。研究表明，apo(a)中的K4可分为T1~T10 10种不同型，除T2外，其他型均只有1个拷贝。T2所含拷贝数不等，为3~40个以上重复拷贝。apo(a)多态性的来源可能与糖化的程度及其分子中所含的K4数目有关，后者是主要的原因。apo(a)基因多态性决定分子大小多态性与血浆Lp(a)水平，如K4的等位基因数决定Lp(a)水平变化的70%。apo(a)分子大小与血浆中Lp(a)的浓度通常成反比，高分子量表型的血清Lp(a)水平低，反之则高。
人群中血浆Lp(a)水平多呈高度偏态分布，个体差异大(0~1000mg/L)。Lp(a)与LDL不同，并不是由VLDL转化而来，也不能转化成其他脂蛋白，是一类独立的由肝脏合成的脂蛋白，其分解代谢可能主要经非特异途径(非LDL受体途径)。有关Lp(a)的生理功能仍不明确。许多个体的血浆Lp(a)水平为零或很低，但并没有引起任何缺乏症或疾病。Lp(a)最可能的生理作用是参与伤口早期的修复过程。在组织损伤时，细胞外基质暴露于血液中，将Lp(a)“捕获”至伤口处，另外中性粒细胞可增强Lp(a)对内皮和平滑肌细胞的粘附，Lp(a)既可为伤口提供修复所需脂质，又可促进炎症细胞如单核细胞内流。Lp(a)易沉积于血管壁，并可促进平滑肌细胞生长及抑制纤维蛋白溶解，这可能是其促AS和血栓形成的机理所在。修饰后的Lp(a)所致动脉粥样硬化的作用和致血栓性均明显增强。有研究观察到，OX－Lp(a)可诱导血管内皮细胞分泌P-选择素和血小板源性生长因子明显增加。有文献报道，Lp(a)可剌激血管平滑肌细胞生长。
二、Lp(a)的测定方法1、概述：早期检测Lp(a)多用电泳法，观察b和前b脂蛋白之间是否出现额外的Lp(a)区带，但此法灵敏度低，多用于定性检测。随后相继研制开发出一些直接测定Lp(a)的免疫化学检测法，如辐射状免疫扩散法(RID)、电免疫扩散法(EID)、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫浊度法[包括免疫散射比浊法(INA)和免疫透射比浊法(ITA)]、解离增强配体荧光免疫测定法(DELFIA)等。RID法与EID法因操作简便，不需特殊设备，仍有一些基层单位实验室采用，但缺点是灵敏度低。RIA法的缺点是操作复杂，有放射性核素污染。DELFIA法因需特殊仪器，国内也较少应用。各种方法测定Lp(a)所得参考值相近，目前国内外所采用的判断标准基本相同。一般认为300mg/L为临界水平，大于300mg/L以上为病理水平。
2、ELISA法：国内外商品试剂盒多采用直接法或非竞争双抗夹心法。此法的主要优点是 (1)标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。
(2)基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物(如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物)。但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素(如粘度、pH等)的影响。" href="http://www.cmechina.net/cme/html/cme_K3000008/0503/index.html#">基质效应(matrix effect)不明显、灵敏特异、抗体用量少、血清标本用量少、操作简便、不需要特殊仪器，一般实验室均可开展。缺点是精密度较差，难以自动化，易出现交叉反应(如与PLG、apoB)。研究表明，用apo(a)多克隆抗体(PcAb)作为包被抗体，apo(a)PcAb或apoB PcAb作酶标抗体，结果均呈现用apoB酶标抗体测定Lp(a)低于apo(a)酶标抗体。有人主张用apoB酶标抗体以彻底排除PLG干扰。用人Lp(a)制备的兔或羊抗血清应吸收PLG及apoB后才能应用。制备单克隆抗体(McAb)时，选择只作用于apo(a)的抗原位点，而与PLG及apoB没有交叉反应的抗体，且最好选择不表达K4T2抗原决定簇的McAb，以免测定结果受apo(a)分子大小的影响。常用的反应体系为：用亲和力高的抗apo(a) McAb或 PcAb作为包被抗体，用以捕获标本或标准血清中的apo(a)，用不表达K4T2抗原决定簇的抗apo(a) McAb或抗apoB抗体(PcAb或McAb均可)作为测定抗体(酶标抗体)。近来也有作者选用不同抗apo(a)K4T5~蛋白酶区的McAb株分别作包被抗体与酶标抗体，以避免apo(a)分子多态性的影响。Marcovina等建议对于商品定标血清，可用Lp(a)的蛋白质表示，分析原始标准物的氨基酸，根据apo(a)或apoB的氨基酸组成计算apo(a)蛋白的摩尔浓度，然后用此原始标准去标定新鲜冰冻血浆中的Lp(a)浓度(nmol/L)。
