克劳斯法测定纤维蛋白原及其影响因素
【摘要】 目的 探讨克劳斯法的影响因素，以推荐在我国临床实验室应用克劳斯法测定纤维蛋白原。方法 分别采用进口试剂盒和国产试剂，建立各自的纤维蛋白原标准曲线，并通过对标准品的测定进行比较，探讨缓冲液pH、凝血酶浓度和测定温度对测定结果的影响。结果 应用国产试剂，建立的克劳斯法，重复性良好，日内CV=0.039 1，日间CV=0.049 7。对标准品分别用进口试剂盒和国产试剂进行测定，相对误差分别为+3.17%、+4.76%和-6.03%。对1份冻干血浆测定，两者结果相近。结论 完全可用国产试剂代替价格昂贵的进口试剂盒，有利于克劳斯法在国内的推广应用。 The von Clauss method for fibrinogen assay and its influential factors
CHENG Feng WANG Dan ZHU Xiaohui
（Center for Medical Laboratory, Fuzhou General Hospital, Fuzhou 350025, China）
【Abstract】 Objectives To study the influential factors of the von Clauss method and to promote the method for fibrinogen assay in clinical laboratories in China. Methods Kits of foreign and domestic products were used. Calibration curves for fibrinogen determination were established, and calibration plasma was used for comparison. Effects of pH value, thrombin activity, and temperature on the measurement were studied.ResultsThe reproducibility of the von Clauss method using domestic thrombin and related reagents was excellent, the within-day CV being 0.039 1, and the between-day CV 0.049 7. The percentage variations of calibration plasma determination, with the foreign fibrinogen assay kits using domestic reagents, were +3.17% , +4.76%, and -6.03%, respectively. Determination of a lyophilized plasma using the two sources reagents showed similar results.Conclusions Thrombin and relevant reagents produced in China could be used as a substitute for kits purchased abroad, which would promote the use of von Clauss method in clinical laboratories of China.
【Key words】 Fibrinogen;Thrombin;Plasma
冯*克劳斯法（ von Clauss法）是美国国家临床检验标准委员会（NCCLS）推荐的纤维蛋白原（Fib）常规测定方法［1］。该法在国外已广泛应用，在我国目前只有少数实验室采用，大部分单位仍采用盐析法、热浊度法和加钙（或凝血酶）形成纤维蛋白原后的双缩脲比色法。究其原因，主要是克劳斯法中所用的主要试剂为高质量的凝血酶和纤维蛋白原标准品，国内尚未能大量供应。为了在我国尽快推广准确、快捷和实用的克劳斯法，并与国际接轨，我们对该法进行了系统的实验观察，并试图全部用国产试剂进行测定。
材料与方法一、材料
1.试剂：(1)Stago 公司的Fibri-Prest试剂盒；(2)国产凝血酶（100 IU/ml）：由本中心自行提取纯化和湖北省某公司生产的供外用的凝血酶；(3)咪唑 (imidazole) 缓冲液：咪唑3.4 g，氯化钠5.85 g，加入约500 ml水中，再加入0.1 mol/L盐酸186 ml，调至pH 7.3～7.4，最后加蒸溜水至1L［2］ 。
2.血浆：(1)Fib标准冻干标准品：由Stago公司提供（Cat. No.00625）；(2)自制冻干血浆：由本中心提供。
二、克劳斯法操作方法
方法一：采用Stago 公司的Fibri-Prest试剂盒（Cat. No. 00608），操作严格按说明书进行。
方法二：由于进口试剂盒价格昂贵，不利于克劳斯法在国内的推广。我们采用国产凝血酶和以进口Fib标准品校准的自制血浆标准品进行克劳斯法测定。
1.用咪唑缓冲液按1∶10稀释血浆。
2.将测定管放置37 ℃，加入测定样品（标准或稀释好的血浆）0.2 ml，37 ℃温育2 min，再加入已预温的0.2 ml凝血酶，立即启动秒表。
3.约6 s后，用一带钩的小棒于试管中间有规律地上下挑动（每0.5～1 s挑动1次），直到纤维丝出现，记录凝固时间(s)。重复测定两次（两次结果相差应小于1 s），取其平均值。
3.若凝固时间在8～25 s之间，可从标准曲线直接查出相应的Fib值。若Fib含量过高，凝固时间少于8 s ，则按1∶20或1∶30稀释血浆，重新测定，结果乘以2或3。若Fib浓度过低，凝固时间大于25 s，则按1∶5或1∶2稀释血浆，结果除以2或5。
三、标准曲线的制作
1.采用Stago公司的Fibri-Prest试剂盒制作标准曲线：(1)将Stago公司的冻干标准血浆（Cat.No.00625，Fib值为3.15 g/L，该产品说明书说明是按暂用的国际标准品89/644定值）用1ml蒸馏水溶解，30 min后，分别取8、12、16、20、24、28、32 μl，加入相应体积的缓冲液，使稀释血浆总体积为200 μl。(2) 按Fibri-Prest试剂盒说明书操作，记录各管凝固时间。(3)以凝固时间为横坐标，对应的Fib浓度(g/L)为纵坐标，制作标准曲线。实际应用时，可将凝固时间与Fib含量列成对照表，使用更为方便。
2.国产试剂的标准曲线制作：以Stago公司的冻干Fib标准品（Cat.No.00625）作标准，或用该公司标准品，校准自制的新鲜和冻干血浆作为标准品，用国产凝血酶和自配的咪唑缓冲液，按方法二进行Fib测定，并制作标准曲线。
