低密度脂蛋白胆固醇的检测方法与标准化研究

众多流行病学、遗传学与临床研究证实，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)的发生率呈正相关，通常以高LDL-C作为CHD的首要致病因素。美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗专业组规定以LDL-C水平作为高脂血症的分类与治疗基础及需要达到的治疗目标。作者参考新近有关文献，对LDL-C的检测方法及标准化问题作一简述。

一、LDL的生物化学

LDL是一组不均一的富含胆固醇的脂蛋白颗粒，漂浮密度(d)为1.006～1.063 kg/L。LDL中胆固醇酯(CE)、磷脂(PL)、蛋白质(Pro)、甘油三酯(TG)和未酯化胆固醇含量分别约为38%、22%、21%、11%和8%。应用非变性梯度凝胶电泳法或密度梯度超离心法可将LDL分为3种或更多亚组分，其名称也因实验方法而异。在LDL亚组分中有一部分LDL的颗粒较小(直径＜26 nm)，密度较大(1.04～1.06 kg/L)，称为小而密LDL(small，dense LDL)，亦称B型LDL；一部分LDL的颗粒较大(直径＞27 nm)，密度较小(1.02～1.03 kg/L)，称为大而轻LDL(large，buoyant LDL)，亦称A型LDL；介于两者之间的亚组分称中间型LDL^［1］。近年小而密LDL与CHD的关系越来越受到重视，小而密LDL升高，或在整个LDL中所占比例升高与致AS的脂蛋白表型之间有着密切关系，这种脂蛋白表型常有HDL水平低和高TG血症的特征。

二、LDL-C的测定方法

测定血清LDL-C通常需根据各种脂蛋白密度、颗粒大小、电荷或apoB含量等，应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将LDL与其他脂蛋白分离开，然后测定LDL组分中胆固醇含量。公式计算法在临床与科研中应用较广，近年相继报道一些均相测定法已引起人们极大兴趣与广泛关注。

1.超速离心法：美国疾病预防与控制中心(CDC)测定LDL-C的参考方法为超速离心法(Beta- quantification，β-定量法)，也为NCEP所推荐^［2，3］。方法基本同HDL-C测定。即用超速离心法除去VLDL组分(d＜1.006 kg/L)后，测定d＞1.006 kg/L组分的总胆固醇(Chol)含量，减去HDL-C。计算方法：［LDL-C］=［d＞1.006 kg/L Chol］-［HDL-C］。此法测定的LDL-C，实际上包括脂蛋白(a)［Lp(a)］和中间密度脂蛋白(IDL)的胆固醇含量，也是评价其他检测方法准确性的基础。目前尚没有真正意义的测定LDL-C的参考方法。β-定量法需昂贵的设备、操作复杂、费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。

2.Friedewald公式计算法：此法是目前应用较广的估测LDL-C的方法，其以VLDL组成恒定(VLDL-C/TG=0.2，均以mg/dl计）的假设为前提，具有简便、直接、快速等优点。计算公式为：(1)LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2(以mmol/L计)。(2)LDL-C=TC-HDL-C-TG/5(以mg/dl计)。应用此公式计算LDL-C常受TC、TG和HDL-C变异的影响。Friedewald公式法计算LDL-C的总变异达9.5%，故需要TC、TG和HDL-C测定结果准确且符合标准化的要求^［2］。如某项测定值误差较大，则会导致计算结果不可靠，因而使其临床应用受到更多挑战与限制。下列情况不宜采用Friedewald公式法计算：(1)血清中存在CM。(2)血清TG＞4.52 mmol/L(400 mg/dl)时。(3)血清中存在异常β脂蛋白时［Ⅲ型高脂血症(HLP)］^［3］。近来Planella等^［4］报道一种根据apoB、TC和TG估算LDL-C的新公式，其不受高TG血症影响，可准确用于非乳糜微粒血症的分类。Planella公式为：LDL-C=0.41 TC-0.32TG+1.70 apoB-0.27(TC、TG以mmol/L计，apoB以g/L计)。此法测定LDL-C的不精密度为1.45%，低于Friedewald公式法(2.97%)，与β-定量法结果明显相关。应用此法将非乳糜微粒引起的高脂血症进行分类，其与β-定量法分类的平均符合率为96.8%，亦高于Friedewald公式法(93.0%)。该公式法不受高TG的影响，在一些方面更优于Friedewald公式法。但此法易受apoB测定结果的影响，需对其测定进行标准化。

3.化学沉淀法：常用方法为肝素-枸橼酸钠法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多环表面活化阴离子法等。血清中LDL经选择性沉淀后，测定上清液中的Chol代表HDL-C与VLDL-C之和，用TC减去上清液Chol即得LDL-C值。因PVS法为非离子反应，实验条件要求不高，在pH 3～8范围内均可完全沉淀且PVS不干扰酶法测定Chol，故目前商品试剂多采用PVS法。中华医学会检验学会在国内推荐PVS法作为LDL-C测定的常规方法^［5］。本法沉淀物中也包含IDL和Lp(a)。Lp(a)与LDL的化学组成、物理性质和免疫原性极为相似，Lp(a)含胆固醇约30%，在Lp(a)增高时，可从LDL-C测定值中减去Lp(a)×0.3(以mg/L计)。特别是在低LDL-C水平时，最好同时测定LDL-C与Lp(a)，否则可能掩盖高Lp(a)的存在，也便于校正LDL-C值及比较两项指标在冠心病危险因素估计作用中的大小^［6］。但目前亦存在一些争议。这类方法主要缺点是TG水平较高(＞4.52 mmol/L)时，有时因LDL沉淀不完全而使结果偏低。Reference Diagnostics公司近来推出一种简便可靠的磁性分离法测定LDL-C的试剂盒，其原理是血清与磁性分离剂混合后37°C孵育10分钟，然后将分离管放在磁性物表面，LDL颗粒在多聚阴离子作用下因被磁化而很快被去除。用TC减去上清液中非LDL-C含量即为LDL-C值^［7］。此方法简单迅速，结果准确，精密度高(批内、批间CV均＜2.5%)，与Friedewald公式法相关性好(r=0.942)，与β-定量法结果一致。此法不受高TG干扰，有一定应用价值。

4.免疫分离法(Immunoseparation Method)：由Leary等^［8］于1993年首先报道，Genzyme Diagnostics建立的一种相当简便直接测定LDL-C的方法。目前Sigma及其他一些公司已有可供临床应用的商品试剂盒。先将200 μl用PEG和结合有抗人apoE、apoAⅠ多克隆抗体的胶乳珠分离试剂与30 μl血清标本同时加到专用分离管的内管(含200 nm滤膜)中，混匀后置室温5～10分钟，让血清中HDL(含apoAⅠ/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAⅠ/E)与分离试剂中的抗体反应结合；然后以1 200～12 000×g(一般为2 200×g)速度离心沉淀5分钟；置室温平衡后，取出并弃去内管；用酶法测定分离管外管中滤液胆固醇含量，即可确定血清LDL-C水平。国外已有许多作者对此法进行了系统评价^{［2，8～10］}。多认为此法精密度好(批内、批间CV＜3%)，准确度高，特别是对于低LDL-C浓度的测定结果准确。与β-定量法有较好相关性，不受高TG水平的影响，可用于禁食或非禁食标本的检测。缺点是需专用分离管，试剂成本较高，难以自动化。且不适于冰冻或冻干标本的测定，如用冰冻标本LDL-C值会下降达25%，用冻干标本可产生50%～75%的负偏差。Levinson等^［11］认为免疫分离法应用范围相当有限，对于空腹血清TG＜4.52 mmol/L的患者和TG在1.70～2.83 mmol/L的多数患者，用Friedewald公式法估算LDL-C似乎更好。免疫分离法可用于TG＞4.52 mmol/L的少数患者LDL-C的检测，对于极少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的测定亦有一定应用价值。