不同方法的胆红素试剂比较
胆红素的测试一直困扰着检验界，目前市场上主要有重氮法、钒酸盐法、氧化法、KHC3法等，请各位就以上几种方法结合临床应用讨论一下他们的优缺点，供大家参考。
中生直接胆红素试剂盒使用说明书
Direct Bilirubin Kit（D.Bili）
重氮法 通用型（液体）
本试剂用于测定人血清中直接胆红素的浓度。
测定原理：
氯化重氮苯磺酸+NaCl
偶氮胆红素（红紫色）
试剂盒主要成分与浓度：
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试 剂 |
主 要 成 分 |
实验浓度 |
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R1 |
EDTA 对氨基苯磺酸 盐酸 |
1.0mmol/L 2.6mmol/L 17mmol/L |
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R2 |
亚硝酸钠（避光保存） |
25mmol/L |
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直接胆红素标准 （另购） | ||
试剂稳定性：原装试剂在2~8℃避光保存，有效期12个月。
工作液在2~8℃可稳定7天，室温下可保存24小时。
样品：新鲜无溶血血清，肝素或EDTA血浆。
操作步骤：
波长：546nm（540~560nm）
反应温度：37℃ 比色杯光径：1cm
将R1与R2以40:1比例混合，即成工作液。
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试剂 空白 |
试剂 |
标准 空白 |
标准 |
样品空白 |
样品 |
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R1 |
2.00ml |
— |
2.00ml |
— |
2.00ml |
— |
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工作液 |
— |
2.00ml |
— |
2.00ml |
— |
2.00ml |
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生理 盐水 |
0.08ml |
0.08ml |
— |
— |
— |
— |
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标准 |
— |
— |
0.08ml |
0.08ml |
— |
— |
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样品 |
— |
— |
— |
— |
0.08ml |
0.08ml |
分别混合均匀，在37℃保温5分钟，分别读取吸光度A（在60分钟内吸光度保持不变）。
计算：
直接胆红素浓度（µmol/L或mg/dl）
C=[(A样品－A样品空白 )－(A试剂－A试剂空白)] ×F*
F*=C标准/[(A标准－A标准空白)－(A试剂－A试剂空白)]
此F*值为用BM公司cafs.标准或中生直接胆红素标准（另购）定标所测。
参考值：
0~5.1µmol/L (0~0.3mg/dl)
参考文献：
Thomas L (ed) Labor and Diagnose,4a ed.Marb-
urg:Die Medizi-nische Verlagsgesellschaft, 1992:235
各医院应根据本地区实际情况建立自己的正常值。
线性上限：直接胆红素浓度可达171µmol/L(10mg/dl）
注意事项：
1. 样品中直接胆红素含量高于171µmol/L （10mg/dl）时，用生理盐水稀释后再重新测定，结果乘以稀释倍数。
2.由于胆红素遇光分解为胆绿素，因此采血后请尽快进行测定，如果不能及时测定，血清应避光冷冻保存。
3.溶血时可能会出现负值。
4. R2应避光保存，R2变黄则不能使用。
5. 使用本公司生产的“直接胆红素试剂盒”，必须同时使用BM公司的cafs.标准或中生直接胆红素标准（另购）定标。
6.本试剂盒不带标准，若有需要可另购中生公司的直接胆红素标准。
7.本试剂盒仅可作为单一试剂使用，不能作为双试剂上机使用，如需使用，请购买直接胆红素液体双试剂盒。
8.本产品仅用于体外诊断，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。
9.本产品应在2~8℃条件下贮存，避免在2~8℃以上及0℃以下存放。
中生直接胆红素（D.Bili）液体试剂盒说明书
钒酸盐法
用途：
本试剂用于测定人血清中直接胆红素的含量。
测定原理：
在特定条件下（pH3.0），血清中胆红素与钒酸反应，生成胆绿素，其在450nm处吸光度的下降与血清中直接胆红素含量成正比。
试剂成分与浓度：
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试 剂 |
成 分 |
实验浓度 |
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R1 |
酒石酸缓冲液（pH3.0） |
100mmol/L |
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表面活性剂 | ||
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R2 |
偏钒酸钠 |
4mmol/L |
|
胆红素标准（钒酸盐法） |
另购 | |
试剂稳定性：
原装试剂在2~8℃避光保存，有效期12个月。
样品：新鲜无溶血血清，肝素或EDTA血浆。
操作步骤：
波长：主波长 450nm 副波长 540nm
反应温度：37℃ 比色杯光径：1cm
将R1与R2按4:1比例混合，即成工作液。
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试剂 空白 |
试剂 |
标准 空白 |
标准 |
样品 空白 |
样品 |
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样品 |
— |
— |
— |
— |
10µl |
10µl |
|
标准 |
— |
— |
10µl |
10µl |
— |
— |
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蒸馏水 |
10µl |
10µl |
— |
— |
— |
— |
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R1 |
350µl |
— |
350µl |
— |
350µl |
— |
|
工作液 |
— |
350µl |
— |
350µl |
— |
350µl |
分别混合均匀，在37℃保温5分钟，分别读取吸光度A。
计算：
样品中直接胆红素浓度（µmol/L或mg/dl）
C=[(A样品－A样品空白 )－(A试剂－A试剂空白)] ×F
F=C标准 / [(A标准－A标准空白)－(A试剂－A试剂空白)]
1.0mg/dl相当于17.1µmol/L
参考值：
0~6.84µmol/L (0~0.4mg/dl)
各医院应根据本地区实际情况建立自己的正常值。
线性上限：直接胆红素浓度可达256.5µmol/L(15mg/dl)
注意事项：
1. 样品中直接胆红素含量高于15mg/dl时，用生理盐水稀释后再重新测定，结果乘以稀释倍数。
2. 由于胆红素遇光分解为胆绿素，因此采血后请尽快进
行测定，如果不能及时测定，血清应避光冷藏保存。
3. 溶血严重时可能会出现负值。
4. 本试剂盒不带标准，若有需要可另购中生公司的胆红素标准（钒酸盐法）。
5. 本产品仅用于体外诊断，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。
6本产品应在2~8℃条件下贮存，避免在2~8℃以上及
0℃以下存放。
迈克直接胆红素（DBil）试剂盒—氧化法
用途： 本试剂用于测定人血清中直接胆红素的含量。适用于全自动生化分析仪。 原理： 样品中直接胆红素在pH3.0附近，以及氧化剂和表面活性剂作用下，可以被氧化成胆绿素。与此同时，胆红素特有的黄色也随之消失。测定反应前后吸光度的差，即可计算出样品中直接胆红素的浓度。 胆红素 试剂盒组成： R1： 缓冲液 Good’s缓冲液 100.0mmol/L 反应促进剂、抗干扰剂 R2： 反应液 氧化剂 4.0mmol/L 本试剂盒不附校准品，请用户另行购买。 样品要求： 样品为新鲜无溶血现象的血清。样品应在低温条件下运输保存，样品中直接胆红素2～8℃密闭避光保存可稳定3天，冰冷保存可稳定3个月。标本收集后应尽快分离血清进行测定。 测定步骤： 1. 基本参数： 方 法：终点法 样品/试剂：1/35 主波长： 450nm 反应温度： 37℃ 副波长： 546nm 反应时间：10min 2. 操作： 测定（U） 校准（S） 空白（B） 样 品（ml） 0.01 -- -- 校准液（ml） -- 0.01 -- 蒸馏水（ml） -- -- 0.01 试剂R1（ml） 0.28 0.28 0.28 混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零450nm测吸光度A1 试剂R2（ml） 0.07 0.07 0.07 混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零450nm测吸光度A2。 操作流程图： 蒸馏水调零 ←——测定——→ ↑ ↑ 副波长546nm 试剂R1：0.28ml 试剂R2 ：0.07ml 样 品：0.01ml
直接胆红素（D-Bil）测定试剂盒 KHC3法 【用途】 本试剂是定量检测血清或血浆中直接胆红素的含量。
货 号 内 容 IR750-X 1．直接胆红素试剂 2×100ml IR750-R 1．直接胆红素试剂 4×200ml
【分析原理】
在电子传递体KHC3存在下，结合胆红素被氧化生成蓝绿色的显色基团。未结合胆红素在此条件下未被溶解，仍与白蛋白结合，所以不能进行直接检测。
KHC3
结合胆红素 ───→ 胆蓝素
（黄色） （蓝绿色）
IR750试剂在700nm处，有一很轻微的吸光度，在750nm处有很明显的吸光度，在同一波长下，以不含有胆红素的血清作为样本，会引起吸光度轻微降低，而以水作为样本则不会使吸光度降低。因此，必须使用零点校准物和Synermed® IRCal 2的参考血清进行校准或使用含有高值和低值的参考血清一齐进行定标。零点的校准物是模拟血清的影响作为空白。
【试剂组成】
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试剂1（R1）直接胆红素试剂 |
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盐酸 0.16N |
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KHC3 3mmol/l |
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增溶剂 |
【试剂贮存及稳定性】
试剂可在室温20~25°C下保存至有效期。
【样本要求】
选择新鲜抽出的，空腹病人无溶血的血清或肝素抗凝的血浆样本。血清要迅速与细胞分离最大限度地减少溶血。文献记录显示，血浆可作为样本使用，血浆与血清结合胆红素的值没有差别。
血清中的结合胆红素在白光照射下（人造或者阳光）都会使胆红素被氧化或脱氢生成胆绿素或者其它的中间产物。血清中的胆红素在光照一个小时后将会下降50%的浓度。最佳的保存方法是避光和低温保存。样本在室温下避光保存可稳定2天，冷藏避光保存可稳定4~7天，冰冻避光保存可稳定3个月。
【操作程序】
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1．试剂准备：试剂在使用前无需特别准备，可直接使用。 | |||||
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2．基本参数： | |||||
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测定模式 |
终点法 |
波长 |
700nm | ||
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比色杯光径 |
1cm |
温度 |
37°C | ||
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孵育时间 |
4~5分钟 |
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3．手工操作： | |||||
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a．选择设置700nm波长 b．调整反应温度37°C c．血清/血浆/定标液/质控与试剂按1:10的比例混匀 d．孵育4~5分钟后读取样本终点吸光度（也可用双波长进行检测，副波长在740~770nm。用主波长测得的吸光度减去副波长的吸光度，得到DA。） | |||||
【定标】
推荐使用直接胆红素零定标液和IR CAL 2定标液进行两点定标。以蛋白作为基质的IR CAL 2含有大约5mg/dl（86mmol/l）的直接胆红素，可对此方法进行校准。每个月进行定标一次。
【质控】
每一个实验室应该在测量未知样本的同时检测质控物。推荐检测每一批样本时应同时与正常值和异常值的质控一同检测并确保质控在可接受的范围内。一般的质控物可适用，并且结果必须在实验室所建立的标准之内。
【结果计算】
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可以从两个参考物进行定标制成的定标曲线或由零点的定标物和IRCal制成的定标曲线中查出样本浓度，也可以根椐以下公式求出结果： |
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样本浓度= 因子 × DA样本 |
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DA样本是由样本的吸光度减去用零点的校准物作为样本所测得的吸光度 |
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例如：A样本=0.050A700nm |
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因子=252.5 |
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样本浓度=0.050×252.5=12.6mmol/L（0.74mg/dl） |
【参考范围】
成人：0~0.3mg/dl（0~5mmol/l）
直接胆红素的水平根据性别、年龄和饮食而变化，强烈建议每个实验室建立自已实验室参考值。
【试剂性能】
1．线性范围：0~10mg/dl（0~171mmol/l）。
如果样本中直接胆红素水平高于此值，应用去离子水稀释样本重做，结果乘以稀释倍数。
2．精密度：批内 CV < 8.2%
批间 CV < 7.6%
3．灵敏度：0.02mg/dl
【注意事项】
1．血红蛋白浓度低于1000mg/dl时，对测试没有影响。
2．脂血（内脂）浓度低于750mg/dl时，对测试没有影响。
3．血红蛋白（血液替代品）浓度低于1000mg/dl时，对测试没有影响。
4．尿液中尿蓝酶的浓度水平在0.5mmol/l和1.0mmol/l时，对测试没有影响。
5．关于由生物学或方法学所引起的干扰,请参阅有关资料。
我觉得KHC3法最优秀的地方是解决了胆红素试剂的稳定性问题。其他试剂都必须在2－8℃保存，而此试剂则可在常温下保存，这是一个很大的突破。
胆红素难做的原因一个是试剂不稳定，第二是标准品不稳定，这给仪器定标带来困难，所以许多试剂都没有胆红素标准，而由厂家直接给出参考因子。但由于试剂和仪器方面的因素，这个因子会有差异。所以有时同一个病人在不同的医院所测出的结果相差很远，甚至相差近十倍。
