医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:36

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila, LP)常引起人类军团菌肺炎散发和暴发。在临床诊断和流行病学调查中，病原体LP的分离较重要。 国内外常用分离方法^［1，2］操作过程复杂、酸预处理抑制LP生长、标本中含菌量少、杂菌抑制等诸因素导致阳性检出率低。本实验建立的增菌法分离LP和研制的选择性增菌培养基(ABYE)，可提高阳性分离率和减少常规分离方法实验步骤。

一、材料与方法

1.培养基：（1）选择性增菌培养液(ABYE)：基础增菌液(BYE)无菌加入万古霉素1 μg／ml，多粘菌素B 20 U／ml，放线菌酮8μg／ml分装备用。BYE成分：氨基乙酸3 g/L,酵母粉10 g/L,ACES 10 g/L,KOH 2 g/L,焦磷酸铁250 mg/L,L-半胱氨酸盐400 mg/L，pH 7.0。(2)Oxoid公司生产的生长培养基（BCYE）。（3）常规分离用选择性培养基（GVPC）及各种生化反应培养基自制^［1］。

2.标准菌株及试剂：LP标准菌株分别为ATCC33152、 ATCC33154、ATCC33155、ATCC33156、ATCC33216、ATCC33215、ATCC33823、ATCC35096源于流行病学学研究所。聚合酶链反应(PCR)试剂、地高辛标记探针杂交检测试剂盒分别为华美、BM公司产品。

3.标本：临床标本28份，环境标本108份，共136份。

4.方法：（1）纯培养及菌液浓度测定：LP标准菌经BCYE烛缸中37℃培养48小时后获纯培养。LP纯培养经无菌蒸馏水制成悬液，10倍系列稀释后取0.1 ml接种BCYE，无菌三角棒均匀涂布，每种浓度2块平板，培养48小时后计数菌落平均数。根据稀释倍数计算菌液中所含活菌数，即菌液浓度CFU／ml。（2）BYE对各型LP标准菌增菌效果：定性试验：接种适量浓度的各型菌悬液0.1 ml于BYE培养48小时混匀后观察生长液浊度。定量试验：选择LP1型标准菌按方法（1）测定培养前后菌液浓度，计算增菌倍数。（3）ABYE中抗菌素浓度对 LP 生长影响： 制备含万古霉素、多粘菌素B、放线菌酮不同浓度的ABYE，将一定浓度的LP1菌液0.1 ml分别接种含不同抗生素浓度的ABYE中，按方法（1）测培养后的ABYE菌液浓度，观察抗生素浓度对LP生长的不同影响。（4）增菌法的建立：将2 ml标本无需处理接种ABYE，37℃烛缸中选择性增菌培养48小时后取0.1 ml培养液转BCYE划线培养，48小时后挑取可疑菌落鉴定。（5）常规法^［1，2］：将2 ml标本等量酸处理15分钟，再用等量碱中和后取0.1 ml接种选择性GVPC平板，培养72小时后挑可疑菌落分纯。（6）分离菌株鉴定，计算两法阳性率及χ²分析。

二、结果与讨论

1.接种10⁵CFU／ml各型LP标准菌0.1 ml于BYE培养后，肉眼可见明显混浊。定量实验测定经BYE增菌后浓度为6×10¹⁶CFU／ml，增菌倍数约10¹¹。附表显示3种抗生素浓度对LP生长影响，其中多粘菌素B影响最大，选择20～40 U/ml适宜。

附表 抗生素浓度对LP生长影响

编号	接种菌量 CFU	抗生素浓度	ABYE培养后 菌液浓度 CFU/ml
万古霉素 μg/ml	多粘菌素B U/ml	放线菌酮 μg/ml
1	5×1013	1.0	80	0.0	2×104
2	5×1013	0.0	80	8.0	3×104
3	5×1013	1.0	0	8.0	9×1023
4	5×1013	0.75	60	6.0	7×106
5	5×1013	0.5	40	4.0	7×108
6	5×1013	0.25	20	2.0	6×1010
7	5×1013	1.0	20	8.0	5×1010

2.两法检测136份标本，其中6株分离菌与标准菌有相同的形态及生化反应特点，血清学和直接免疫荧光抗体实验显示为LP1、2、4、9血清型菌株。经PCR检测产生与标准菌相同的基因扩增产物，用地高辛生物素标记的探针经斑点杂交检测扩增产物均阳性。增菌法阳性检出率3.7%（5/136），常规法阳性率0.7%（1/136）。χ²检验，P＜0.05，两法差异有显著性，增菌法优于常规法。 3.应用增菌法分离LP，直接对标本选择性增菌，省略了常规法中既繁琐又抑制LP生长的酸处理过程，操作简便易行，阳性分离率较高。抗生素可抑制和杀灭杂菌，但其种类和浓度均影响LP生长，建议实验中视标本污染程度定量。增菌培养基可用于标本运送，特别适合临床呼吸道标本现场采样直接分离。 参考文献

1 武建国主编.军团菌病.南京：东南大学出版社，1990.93-135.

2 Reinthaler FF, Sattler J,Karin SD, et al. Comparative study of procedures for isolation and cultivation of Legionella pneumophila from tap water in hospitals. J Clin Microbiol, 1993,31:1213-1316.

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