聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌
ZHANG Junmin*, zHOU Guimin, XIE Ling, et al.
* Department of Microbiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract 】 Objective To establish a non-culture method for detection and identification of Candida isolates from clinical specimens.Methods The species-specific probes to identify three Candida species, c.albicans,C.tropicalis and C.glabrata, were added homopolymer tails and then inoculated on a nitrocellulose filter. The benzyl chloride method was used for extracting template DNA from Candida isolates. The DNA from each isolate was amplified by PCR with the fungus-specific universal primers, and the PCR products labeled with bio-11-dUTP during amplification were hybridized with the species-specific probe.Results All14 Candida species were amplified by PCR, and non-specific amplificatin for 3 bacteria species was found. The probes reacted with C.albican, C.tropicalis and c.glabrata didn′t react with other Candida labeled DAN.Conclusion PCR-reversed dot hybridization is rapid and simple for detection and identification of medically important Candida species.
【Key words 】 Polymerase chain reaction Hybridization Candida
念珠菌引起全身感染的增加，以及不同菌种对抗真菌剂所具有的不同天然耐药性［1］，要求实验室不仅快速检出感染病原，而且还应准确鉴定到种，才能使临床有效控制感染。目前以培养为基础的传统分离鉴定方法，因需时较长常常延误诊断和治疗。为建立快速检测与鉴定念珠菌方法,我们利用真菌通用（fungus-specific universal）引物PCR，结合念珠菌种特异探针反向斑点杂交(reversed-dot hybri-daization)，对此进行了初步探讨，现报告如下。
材料与方法 一、材料1.菌种：白色念珠菌 ATCC 14083、热带念珠菌981083（临床株）、光滑念珠菌 aTCC 710，以及其他11种临床常见念珠菌和金黄色葡萄球菌 ATCC25923、大肠埃希菌ATCC 25922、绿脓假单胞菌ATCC 27853。
2.真菌特异引物：引物1为5′-GCATCGATGAA-GAACGCAGC-3′，引物2为5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′。种特异探针分别为：白色念珠菌，ATTG-CTTGCGGCGGTAACGTCC；光滑念珠菌，TAGGTTTT-ACCAACTCGGTGTT；热带念珠菌，AACGCTTATTTT-GCTAGTGGCC。引物及寡核苷酸探针参照文献［2］，由军事医学科学院国家生物医学分析中心DNA合成和序列分析实验室合成。
3.Bio-11-dUTP，购自北京医科大学药学院。
4.末端脱氧核苷酸转移酶，购自北京北方同正生物技术发展公司。
二、方法1.寡核苷酸探针加尾：5×Buffer 40 μl，10 mmol/L dTTP 20 μl、15 u/μl TdT 3 μl、10 nmol/L寡核苷酸探针2 μl去离子水135 μl。混匀后放37℃孵育2小时。
2.交联：分别取3种加尾后的寡核苷酸探针点硝酸纤维素膜，每点5μl，待吸附后将膜放入交联仪中，能量 2 000 μJ/cm2，2分钟。
3.预杂交：用5×SSC＋0.5％SDS，在55℃洗膜30分钟后，再用封闭液与膜在37℃作用30分钟。此膜可立刻使用，也可干燥后备用。
4.念珠菌DNA提取：采用氯化苄法［3］。
5.PCR反应：总体积25 μl：Tris-HCl：10 mmol，pH 9.0，KCl 50 mmol，MgCl22.5 mmol，Triton X-100 0.1％、dATP、dGTP、dCTP各200 μmol，dTTP与Bio-11-dUTP合计200μmol（dTTP与Bio-11-dUTP比例为2∶1）、引物1和2各1 μmol、Taq DNA酶1.5U(宝泰科生物技术公司)，DNA模板2μl。94℃预变性7分钟，94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，共30个循环。最后72℃再延伸6分钟。取12μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
6.杂交：PCR扩增产物95℃变性10分钟后立刻放冰浴1分钟以上。将点有3种探针的硝酸纤维素膜放入杂交袋中加1 ml杂交液（5×SSC，2×Denhardt′s液、变性鲑鱼精DNA 190 μg/ml），12μl变性PCR扩增产物。密封后放37℃杂交60分钟。用2×SSC＋0.5％SDS室温洗2次，每次3分钟；0.2×SSC＋0.5％SDS室温洗1次，3分钟；0.2×SSC＋0.5％ SDS 37℃洗1次，5分钟。
