聚合酶链反应微孔板杂交法检测解脲脲原体及药敏分析

【摘要】 目的 建立敏感、特异的聚合酶链反应-微孔板杂交法(PCR-MPH)检测解脲脲原体（Uu）的感染，并分析药敏情况。方法 将带有生物素标记的Uu的聚合酶链反应产物结合在链霉亲和素包被的微孔板上，与标记地高辛的探针进行杂交后，通过标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(anti-DIG-AP)与杂交分子进行反应，最终经底物显色后读数；同时应用生物梅里埃公司支原体培养试剂盒（IST）进行了Uu的培养及药敏试验。结果 通过优化多种试验条件建立了PCR-MPH法检测Uu，并分析了不同人群158份标本，其中微孔板杂交法阳性65份，培养法阳性56份；药敏结果显示，敏感率原始霉素100%、交沙霉素96.6%、强力霉素89.7%、四环素79.3%、氧氟沙星34.5%、红霉素6.9%。结论PCR-MPH法采用非放射性标记，具有无污染、经济、自动读数等优点，可以敏感、特异地检测Uu的感染；Uu对原始霉素、交沙霉素、强力霉素较敏感，对红霉素耐药。 Detection of ureaplasma urealyticum by polymerase chain reaction-microplate hybridization and anti-Uu susceptibility test

ZHAO Xiaotao ZHANG Zheng

（Department of Clinical Laboratory, People′s Hospital, Peking University, Beijing 100044, China）

【Abstract】 Objectives To establish a sensitive and special method for the detection of Ureaplasma urealyticum(Uu) using PCR-microplate hybridization (PCR-MPH). Methods A primer of ureasea gene was labeled by biotin. The amplification product was captured on streptavidin-coated microplates, then products were quantified by hybridization with a digoxigenin-labeled internal oligonucleotide probe. After revelation with an anti-digoxigenin alkaline phosphatase coupled antibody(anti-DIG-AP), the amount was determined by optical reading. At the same time, PCR-MPH was compared with Bio-Merieux Mycosplasma-IST. Results A method of PCR-MPH for detecting Uu DNA was established. The morbidity among three groups for detecting 158 clinical samples was analysed. 65 were detected by PCR-MPH and 56 by culture.Conclusion The results showed that this assay is rapid, sensitive, specific, and accurate, and is of value in clinical therapy.

【Key words】 Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction; Drug resistance, microbial

解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，Uu）作为人类致病微生物，可引起一系列泌尿生殖道感染、性传播疾病，并日益受到人们的重视，尤其他与不育症、孕妇感染及其导致的母婴传播有密切相关性^［1］。目前实验诊断方法各具优缺点，传统的分离培养法对标本采集、培养条件均要求较高；血清学诊断方法不能作为现症感染的主要依据；经典的分子杂交法操作繁琐、有放射性污染；聚合酶链反应（PCR）操作简便，但常规的电泳法判断结果主观性强、敏感性低，存在溴化乙啶污染、非特异条带的影响。为此我们建立了PCR-微孔板杂交法（PCR-MPH）。

一、材料

1.标本来源：48份阴性对照标本取自北京市海淀区妇幼保健医院婚检中心；40份孕妇宫颈拭子取自本院产科门诊；118份患者标本（包括泌尿生殖系统感染88份及男性不育症者精液标本30份）取自北京市东直门外医院性生殖专科门诊及本院泌尿科门诊。

2.标准株来源：Uu1～14血清型标准株由军事医学科学院微生物研究室提供；UuT 960标准株、肺炎支原体标准株、人型支原体标准株、生殖支原体标准株由首都儿科研究所提供。

3.引物及寡核苷酸探针：上游引物U5：5′-CAATCTGCT-CGTGAAGTATTAC- 3′（328～349）；下游引物U4：5′- ACGACGTCCATAAGCAACT -3′（739～757），5′端标记生物素；探针U9：5′-GAGATAATG-ATTATATGTC AGGATCA- 3′（500～525），3′端标记地高辛。序列均经Gene Bank验证，由CyberSyn公司合成。

4.主要试剂及仪器：Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，dNTPs法玛西亚公司产品，碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体（anti-DIG-AP）购自宝灵曼公司。支原体培养试剂盒(IST)为生物-梅里埃公司产品。DNA扩增仪为PE公司产品，酶标板为丹麦Nunc公司产品。

二、方法

1.标本的采集与保存：宫颈拭子、男性尿道拭子，均取2份标本，1份于生物-梅里埃支原体IST培养，另1份置于1.5 ml无菌生理盐水中，充分挤压、振荡后弃去，-20℃保存。精液、前列腺液标本直接留取后取200 μl培养，其余-20℃保存。

2.支原体培养及药敏试验：按试剂盒操作说明进行，置35～37℃培养。24～48 h观察颜色变化，24 h相应的小孔由黄变红或橙色提示Uu生长，48 h相应的小孔由黄变红或橙色提示生殖支原体（Mh）生长；72 h仍不变色者为阴性，变混浊可能为杂菌污染。同时观察药敏结果，有强力霉素、交沙霉素、氧氟沙星、红霉素、四环素、原始霉素6种抗生素共11个药敏孔（除原始霉素为1个浓度外其余均为高低2个不同浓度），相应的药敏孔由黄变红提示耐药，变为橙色提示中介度，仍为黄色提示敏感。