聚合酶链反应微孔板杂交法检测解脲脲原体及药敏分析

3.DNA模板制备：用蛋白酶K消化后用经典的酚、氯仿抽提。

4.PCR扩增：扩增总体系为25 μl，其中模板5 μl，引物均为0.4 μmol/L，dNTP均为0.2 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L pH8.3，KCl 50 mmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1.5 U。循环条件为95℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环。分别取PCR产物进行2%琼脂糖电泳及微孔板杂交检测。扩增片段为429 bp。

5.微孔板杂交法检测PCR产物：（1）包被微孔板：将链酶亲和素以5 mg/L的浓度100 μl/孔包被微孔板，4℃过夜。加入封闭剂（0.01 mol/L PBS pH7.4，3% BSA）200 μl/孔，4℃过夜。（2）产物的捕获及变性：取PCR产物1∶10稀释后以100 μl/孔加入微孔板中，37℃ 1 h后用洗液（10 mmol/L Tris-HCl pH7.5、0.05%吐温-20）洗板，加入150 mmol/L的NaOH溶液100 μl，室温15 min，洗板。（3）杂交反应：加入含地高辛标记探针10 pmol/孔的杂交液（50%去离子甲酰胺、5×SSC、1×FPG、25 mmol/L磷酸盐、2 g/L SDS、50 g/L硫酸葡聚糖）100 μl/孔进行杂交反应,37℃ 45 min。（4）酶显色：洗板后加入1∶2 000稀释的Anti-DIG-AP 100 μl/孔（酶稀释液为100 mmol/L Tris-HCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、10 g/L BSA），37℃ 45 min。充分洗板后加入底物（PNPP 10 g溶于10 ml蒸馏水、87 μl二乙醇胺、加入5 μl 1 mol/L MgCl₂使终浓度为0.5 mmol/L）100 μl/孔，37℃避光显色，2 mol/L NaOH 50 μl终止反应，酶标仪405 nm波长测吸光度A值。

1.杂交特异性试验：Uu14个血清型的扩增产物均与U9探针发生特异性杂交，而肺炎支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体及淋病奈瑟菌均为阴性。

2.杂交敏感性试验：分别取相当于0、1、1×10¹、5×10¹、1×10²、5×10²、1×10³、1×10⁴ CCU/ml（CCU，颜色改变单位）的Uu菌液为模板PCR后进行MPH，与2%琼脂糖电泳比较两者的敏感性（表1）。

表1 不同模板浓度的杂交及电泳结果比较

3.对照人群Uu的PCR-MPH测定：取经婚检筛查无泌尿生殖道炎症的健康未婚的男性尿道拭子、女性分泌物共48份标本进行PCR-MPH，结果显示，其A值均值为0.056，标准差(s)为0.0172，因而依照阴性对照+4s确定MPH试验的cut off值为阴性对照+0.07。

4.批内与批间重复性分析：阳性对照批内CV值为5.4%，批间CV值为13.9%，阴性对照批内CV值为4.4%，批间CV值为10.4%。

5.利用PCR-MPH法与培养法对临床158份标本进行Uu检测（表2）。

6.分析孕妇、泌尿生殖道感染及男性不育症3组人群的Uu阳性结果（表3）。

7.药敏结果：原始霉素、交沙霉素、强力霉素、四环素、氧氟沙星、红霉素，敏感率分别为100%、96.6%、89.7%、79.3%、34.5%及6.9%。

表2 PCR-MPH阳性结果与培养的比较(份数)

表3 不同人群Uu阳性率(%)