实时荧光定量聚合酶链反应检测沙眼衣原体等病原体感染

在性传播疾病中，淋病奈瑟菌(Ng)、沙眼衣原体(Ct)、解脲脲原体(Uu)感染较常见。我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法^［1］对其进行检测，取得了较好效果，报告如下。

一、材料和方法

1.标本来源及取材方法：标本均由本院临床科室从疑有Ng、Ct、Uu感染的患者，取其宫颈、尿道分泌物送检。共检测标本3 346份，其中Ng 1 416份、Ct 1 165份、Uu 765份。取材方法：用消毒棉签插入宫颈口或尿道口捻转并停留数秒。如果男性患者尿道口分泌物过少，则取前列腺液2～3滴。

2.仪器和试剂盒：仪器为美国PE 7700自动荧光PCR仪，FQ-PCR Ng、Ct、Uu试剂盒均为广州中山医科大学达安基因诊断中心产品。

3.试剂盒使用方法：将标本洗涤液12 000 r/min离心5 min，去上清液，采用常规碱裂解法提取Ng、Ct、Uu-DNA。各反应管放入PE7700自动荧光检测仪，按下列条件扩增：93℃5 min预变性，然后按93℃45 s～55℃120 s。共做40个循环。反应结束后，由电脑自动分析计算出定量结果。每批Ng、Ct、Uu试剂盒，均做定量阳性质控。每次检测均做阳性和阴性对照。统计学处理：采用χ²检验。

二、结果

Ng、Ct、Uu的定量阳性质控标准品经FQ-PCR，以起始拷贝数的自然对数为横坐标，以循环阈值为纵坐标，得到一条直线型标准曲线，斜率为-3.4，线性相关系数r＞0.98。

FQ-PCR检测Ng-DNA 1 416份，阳性368份，阳性率26%，阳性标本定量对数平均值：2.3×10⁶。检测Ct-DNA 1 165份，阳性315份，阳性率27%，阳性标本定量对数平均值：8.5×10⁵。检测Uu-DNA 765份，阳性279份，阳性率36.5%，阳性标本定量对数平均值：2.4×10⁴。Uu-DNA检出的阳性率与Ng-DNA、Ct-DNA的阳性率相比，差异有高度显著性(χ²=28.57、P＜0.005)。

三、讨论

我们采用的实时FQ-PCR技术。利用了基因扩增的灵敏性，分子杂交的特异性和光化学的精确性^［2，3］，从根本上解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。与竞争性PCR、PCR-EILA等定量PCR相比^［4］，荧光定量PCR除了有快速、操作简便，无需对PCR产物进行后处理，还具有定量范围宽、定量准确等优点。特别是PE 7700自动荧光PCR仪，采用激光光源，实时定量检测技术。所检测的循环阈值(Ct值)和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确。还可为临床考评疗效提供依据。

参考文献

1 程钢，何蕴韶，周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒.中华医学检验杂志，1999，22：135-138.

2 Gibson, Heid C A, Williams P M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res, 1996, 6: 995-1001.

3 Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al. Real time quantitative PCR. Genome Res, 1996, 6: 986-994.

4 Desjardin L E, Chen Y, Perkins M D, et al. Comparison of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis. J Clin Microbil, 1998, 36: 1964-1968.