简介美国临床实验室标准化委员会最新推荐厌氧菌药敏试验方法及评价
由于厌氧菌的分离、鉴定和药敏试验技术较复杂，并受试验成本高等条件限制，国内很多实验室不能开展厌氧菌鉴定和药敏试验工作。即使是国外，多数临床医生治疗的依据，也是凭经验和文献资料。然而，近10年来，厌氧菌的耐药率不断增高。本讲将探讨常见厌氧菌对常用于治疗厌氧菌抗生素的耐药机制；简要介绍美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2001年最新推荐的药敏试验方式，以及对2种适合常规使用的药敏方法的评价，供临床和实验室参考。
一、厌氧菌耐药机制
厌氧菌耐药机制的形成主要是产酶; 细胞壁通透性改变，使抗生素不能穿透细胞壁，或降低抗生素摄取；使抗生素外排；线粒体突变和耐药基因传递等几种类型。
脆弱拟杆菌是临床标本中分离率最高的厌氧菌之一，耐药发生率最高的是对青霉素类和克林霉素。因产β内酰胺酶或其他酶使抗生素失活，导致对青霉素和氨苄西林耐药。大多数脆弱拟杆菌产β内酰胺酶，阳性率为94%。20年来，脆弱拟杆菌对克林霉素耐药率从1%上升至29%。
通过接合方式在厌氧菌之间传递耐药因子，致厌氧菌耐药。革兰阳性厌氧菌如产气荚膜梭菌和难辨梭菌等，通过接合方式，将携带耐药基因的质粒传递给另一些菌株。拟杆菌属对克林霉素耐药机制与之相似，转座子Tn5030是染色体上一段4500bp+/-5000bp的可转移基因，但它不象典型的革兰阴性菌转座子，具有可被检测的终端复序列。Tn5030将其携带的克林霉素耐药基因ermFV及同源序列转移到质粒上的tetF基因，使敏感菌株产生耐药性。
耐药基因的转移与环境有关，拟杆菌属内传递的耐药基因的接合转座子，具有少见特征，即低浓度抗生素可极大刺激转座子转移。因此抗生素对细菌的作用更多的是促使耐药基因转移，其次才是选择耐药菌株。转座子可以对某个或某些厌氧菌有高度特异性，或与需氧菌有同源基因。人体的定植菌群就象耐药基因库，将耐药基因传递给不同部位的暂住菌，厌氧菌与需氧菌分享和互换基因材料。
二、为什么要做厌氧菌药敏试验？何时必须做？
1. 遇特殊厌氧菌的耐药率因地区而异：厌氧菌的耐药率在不同国家、地区、同一地区的不同医院都不尽相同，使用不同的抗生素治疗方案使厌氧菌耐药类型有明显不同。美国南加州4所医院监测耐药率时发现，其中1家医院的脆弱拟杆菌群对头孢西丁药敏类型显著不同；2家医院脆弱拟杆菌群对哌拉西林敏感类型有差别。
2．关于厌氧菌常规药敏试验：美国NCCLS2001年最新厌氧菌药敏试验方法（第5版），对何时做常规药敏试验和耐药监测时提出，不一定对所有分离的厌氧菌均做药敏试验，但遇特殊感染，如脑脓肿、心内膜炎、关节感染、修复装置感染、血管移植和菌血症，无菌部位分离的厌氧菌均应做药敏试验。此外，医生要求时也应该做。
当同时分离出几种厌氧菌，很难确定做哪个菌的药敏试验时，应选择最具致病性的菌，或治疗时对其敏感性很难预测的常用抗生素做药敏试验。致病菌包括拟杆菌属、梭杆菌属，核梭杆菌、嗜胆菌和Sutterella。
需要做药敏试验尚有其他几种情况：重症患者；当治疗无反应或病情恶化时；当缺 少某种厌氧菌药敏资料时；当充分离菌株耐药率较高时；当必须延长对患者的治疗时间时。
3. 关于厌氧菌耐药监 测：如果一个医院的实验室延长做厌氧菌鉴定，但不做常规药敏试验，就应该每年监测本地常见厌氧菌耐药类型，并定期核实。监测工作可由有条件的医院实验室或参考实验室承担。收集并贮存几个月内分离的菌株50-100株，供一批试验用。这样可节省时间、人力和物力。此外，所选择测试菌株种类应反应测试阶段的分离频率，至少20株拟杆菌，及5至10株其他属常见菌株；抗 生素应选择本医院处方用药和临床适用的抗生素，每类至少一种。每年应发表最新的监测结果，得出耐药趋势。
三、NCCLS最新推荐的药敏方法
2001年美国NCCLS最新推荐 的厌氧菌药敏方法有参考琼脂稀释法（wadsworth method）、肉汤微量法和β内酰胺酶检测3种方法。参考琼脂培养基布氏琼脂，添加溶解的羊血、氯化血红素和维生素K1.
肉汤微量稀释法目前只能用于脆弱拟杆菌的药敏试验，并且只能做标准文件中推荐的有限的抗 生素。
在药敏试验之前，应检测β内酰胺酶的活性。但大多数脆弱拟杆菌的分离株都产β内酰胺酶，被认为对青霉素耐药，不必做β内酰胺酶试验。任何产β内酰胺酶的厌氧菌，不管体外药敏试验结果如何，都应报告对青霉素和氨苄西林耐药。值得注意的是，吉氏拟杆菌和脆弱拟杆菌中的一些菌株，对β内酰胺酶类抗 生素耐药不是因为产β内酰胺酶。因此，当这类菌株β内酰胺酶试验阴性时，不一定对这类抗 生素敏感，需要做药敏试验。
四、厌氧菌药敏方法评价
在NCCLS推荐的药敏试验中，参考琼脂稀释法是最基本的方法，适合所有厌氧菌及大量菌株的研究和监测工作，但比较耗费人力和物力；肉汤微量稀释法只作为脆弱拟杆菌常规检测方法，因为有些苛养厌氧菌生长不好。它适合少量分离菌株常规药敏试验；如果是商品试剂盒，有可能提供的抗生素不适合临床治疗。虽然Etest方法不是NCCLS推荐的药敏方法，但被认为是快速、比较准确和实用的方法，48 h容易判读结果，适合常规检测单个分离菌株。
值得注意的是，不同方法得出的结果之间存在着差异，有时甚至相互矛盾。折点、接种量、培养基添加剂、终点判断、菌株等都会影响药敏试验结果。
1. 肉汤微量稀释方法评价：Aldridge等采用肉汤微量稀释法与参考琼 脂稀释法对照测定脆弱拟杆菌对头孢唑肟和头孢西丁的敏感度。结果显示，肉汤微量稀释法最低抑菌浓度（MIC）低于对照方法2至4个倍比稀释度。NCCLS推荐 用肉汤微量释释法测定头孢唑肟，其体外活性包括对脆弱拟杆菌群，优于头孢西丁、头孢替坦和头孢噻肟对厌氧菌的抗菌活性。
2. Etest方法评价：Rosenblatt等采用Etest法与琼脂稀释法对照测定220株厌氧菌敏感性。用全血布氏平皿，菌悬液配制1个麦氏标准单位。培养24h后，36%结果不可读，与对照结果一致率89%，非常主要错误（VME）即“耐药”错判为“敏感”，为22%；培养48h后，5%结果不可读，与对照结果一致率97.9%，VME减少至3.2%。脆弱拟杆菌属和梭菌属对克林霉素、头孢曲松更容易出现VME，建议判读结果 时尽量保守。Appelbaum等结论基本相似，2种方法MIC结果完全一致率33.4%，80.8%相差1个倍比稀释度，99.0%差2个倍比稀释度，MIC50和MIC90相同或相差1个倍比稀释度。因此，Etest方法基本上是精确和实用的药敏试验方法。
3. 其他适合临床应用的商品厌氧菌药敏系统：ATB ANA(Version 96)系统（系生物梅里埃产品）可按照法国临床微生物学会抗生素分会和NCCLS 2种标准解释结果。Dubreil等评价此系统检测200株临床分离厌氧菌对9种抗生素的药敏结果时，与参考琼脂稀释法进行对照。按照NCCLS标准，与对照法一致率为94.9%，最小错误3.8%，最大错误0.8%，VME为4.2%；按照法国标准还可检测脆弱拟杆菌对甲硝唑低水平耐药。并认为此方法与参考方法相符合，便于临床操作。
1992年对美国120家医院（床位200-1000）厌氧菌检验情况随机调查结果显示，所有医院都做厌氧菌培养，30%实验室不做药敏试验，其余的16%送到参考实验室，54%在本实验室完成。有半数实验室根据标本来源做药敏试验。相比之下，我们之间的差距还很大，我国的微生物检验事业任重而道远。
卫生部临床检验中心 胡继红 高振祥 尹铭芳 摘自《中华检验医学杂志》2002年5月25卷第3期
