医学检验信息网 检验医学 2007-2-26 16:16:46

1 什么是MRSA 金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从本世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。因而人们又研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可时隔两年，英国的Jevons^［1］就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA),MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。因此，开展对MRSA的检测，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。 2 MRSA的特性 2.1 不均一耐药性^［2］ MRSA菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群，即一株MRSA中只有一小部分细菌约10^－4～10^－7，对甲氧西林高度耐药，在50 μg/ml甲氧西林条件下尚能生存，而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死，但少数耐药菌株却缓慢生长，在数小时反又迅速增殖。 2.2 广谱耐药性 MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制^［3］，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，唯对万古霉素敏感。 2.3 生长特殊性 MRSA生长缓慢，在30°C，培养基pH 7.0及高渗(40 g/L NaCl溶液)条件下生长较快^［4］。在30°C时，不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药，在37°C又恢复不均一耐药。均一耐药株在＞37°C或pH＜5.2时，均一耐药性可被抑制而表现为敏感。增加NaCl浓度，低温孵育和延长时间，可使不均一耐药株群体中敏感亚群中的耐药性得到充分表达，即能耐受较高浓度的甲氧西林，而对其中耐药亚群无影响^［5］。但最近也有报道，高渗下延长培养时间，会影响MRSA的检出结果，因为在高盐情况下，培养48 h，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus;MSSA)易产生大量β-内酰胺酶，可缓慢水解甲氧西林，导致细菌生长，而误认为MSSA。所以一般MRSA在高盐环境孵育24 h，而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)由于耐药亚群菌数少于金葡菌，应孵育48小时观察结果。 3 MRSA的耐药机理 3.1 固有耐药 是由染色体介导的耐药，其耐药性的产生与细菌产生一种青霉素结合蛋白(PBP)有关。MRSA产生五种PBP(1，2，3，3′和4)，它们具有合成细菌细胞壁的功能。它们与β-内酰胺类抗生素有很高的亲和力，能共价结合于β-内酰胺类药物的活动位点上，失去其活性导致细菌死亡，而MRSA产生了一种独特的PBP，这种分子量增加了78～1000道尔顿的PBP，因其电泳率介于PBP2与PBP3之间，故称为PBP2a或PBP2′^［6］。PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不被β-内酰胺类药结合。在β-内酰胺类抗生素存在的情况下，细菌仍能生长，表现出耐药性。PBP2a的产生是受染色体甲氧西林耐药基因(mec A)来调节的。MRSA与MSSA根本区别在于它们的PBP不同。 3.2 获得性耐药 是质粒介导的耐药。某些菌株通过耐药因子产生大量β-内酰胺酶，使耐酶青霉素缓慢失活，表现出耐药性^［7］，多为临界耐药。 4 MRSA的分型

MRSA分型对追踪传染源，研究型别与感染种类，耐药性的关系有重要作用。国外开展较早的噬菌体分型，将待测菌于肉汤中，35°C孵育6 h，涂于分型琼脂平板上，待干后将23种噬菌体注入琼脂平板中的小方格内，再置35°C孵育6 h后移至室温过夜观察结果。用4组23种噬菌体，将MRSA分为4群，一般以Ⅰ群为最多^［8］，也有报告以Ⅲ群为多。噬菌体分型结果常不满意，日本小粟 子证实有29.3%菌株不能分型，且重复性差，不宜用于流行病学调查。质粒图谱分型较为可靠，可分为18个型，能准确地分析菌株之间的相关性，将流行菌株与非流行菌株加以区别。国内MRSA广泛存在分子量为1.6 Md、1.8 Md及2.67 Md的质粒，不同地区和不同医院会有特殊质粒带。免疫印迹分型法将MRSA分为9个型，以B、C型为最常见，各型含有特征性的分子带，该法比较稳定。染色体限制性内切酶分析可识别病原体DNA链上特异位点及核苷酸序列，能从基因水平显示病原体特征，MRSA还可用血清学、凝固酶、耐药谱等方法分型。现在Southern印迹法也逐渐运用于MRSA的分型。

5 MRSA的检测

由于MRSA的不均一耐药性，给其检测带来一定的困难。MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响。因此，目前还没有一种最佳的检测方法。

5.1 纸片扩散法(K-B法) 平皿中MH琼脂厚度为4 mm，菌液调至0.5麦氏浊度，涂沫于上述平板，甲氧西林含量5 μg/片，35°C孵育24 h，抑菌圈≤11 mm为耐药，≥17 mm为敏感，由于MRSA通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药，因此美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐用苯唑西林来代替检测MRSA。苯唑西林在贮存过程中药效不易降低，且对不均一耐药性检测效果更好，所以国内多数实验室都采用苯唑西林，苯唑西林含量为1 μg/片，抑菌圈≤10 mm为耐药，≥13 mm为敏感，11～12 mm为中介。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213(耐药菌株)，金黄色葡萄球菌ATCC 25923(敏感菌株)。纸片扩散法最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受。在合适的抗生素及培养温度、菌液的浓度、培养基厚度等条件下，检测MRSA是可行的。但Leneastre等^［9］对K-B法和特异性mec A基因DNA片段法鉴定MRSA的结果进行了比较，发现在49株用K-B法鉴定为MSSA的菌株，特异性mec A基因DNA片段法鉴定却有11株含mec A基因；59株用纸片法鉴定为典型MRSA的菌株，有10株却没有特异性mec A基因，这两种方法大约有18%～20%的差异。Chipman^［10］等研究也表明以mec A基因检测法为参考方法时，纸片扩散法的符合率为88.2%。这可能与纸片法中的琼脂中没有NaCl成份，一些菌株的耐药性得不到完全表达有关。因此，为提高纸片扩散法检测MRSA的可靠性，最好在MH琼脂中加入40 g/L NaCl。 5.2

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