临床细菌检验快速方法应用进展
临床细菌检验程序包括标本分离、菌种鉴定及药敏试验3个步骤，其中菌种鉴定的快慢是影响整个检验时间的关键。因此临床细菌检验快速方法的研究也多以菌种鉴定为主。
一、用分离培养基对菌种直接鉴定
在分离培养基中加入检测某些菌种特异性酶的底物，在菌种分离的同时直接进行鉴定。其原理是人工合成底物由产色基团和微生物可代谢物质如糖苷类、氨基酸或肽类两部分组成，通常情况下底物为无色。在特异性酶作用下游离出产色基团并产生荧光或显示一定颜色，用紫外灯观察菌落产生的荧光或直接观察菌落颜色即可对菌种做出鉴定。目前人工合成底物中常见的产荧光物质为4-甲基伞形酮(蓝色荧光)，化学物质包括对-硝基苯或邻-硝基苯(为黄色)，5-溴-4-氯-3-吲哚(为蓝色)和β-萘胺(红色)等。
白念珠菌是临床标本中最常见的酵母样真菌。Dalton等［1］报道用4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-agalactosaminide,4-MUAG)测定白念珠菌N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷酶(NAG酶)，可100%快速鉴定白念珠菌。目前以4-MUAG为底物直接鉴定白念珠菌的商品化培养基有Fluoroplate(Merk，德国)、MUAG沙保弱琼脂(Biolife，意大利)。临床应用表明这两种培养基可分别正确鉴定所试白念珠菌的98.8%和98.4%［2］。Albicans iD(生物梅里埃，法国)和Candiselect(Sanofi Diagnostics Pasteur，法国)所用底物则为化学产色基团，白念珠菌生长时菌落因所用产色基团不同，呈现不同颜色，据此可鉴定为白念珠菌。对临床标本检测显示，培养24小时可分别鉴定56.5%和37.68%的白念珠菌，72小时后可鉴定92.5%和91.3%，特异性均为100%［3］。CHRO magar Candida (CHRO Magar，法国)培养基则含多种底物，文献［4］报道该培养基可对白念珠菌(为绿色)、热带念珠菌(为蓝色)、克柔念珠菌(为粉红色)进行直接鉴定，37℃培养2天后对此3种念珠菌鉴定的特异性和敏感性均超过99%。
利用特异性酶也可对细菌进行直接鉴定。文献［5］报道大肠埃希菌具有β-葡苷酸酶(β-glucoronidase)，而其他肠杆菌则缺乏此酶。Trepta等［6］将4-甲基伞形酮-β-D-葡苷酸加入肠杆菌分离培养基中，制成FGM培养基直接分离鉴定大肠埃希菌，在紫外灯下产生蓝色荧光的菌落为阳性。该培养基还可对不发酵乳糖的大肠埃希菌进行鉴定。CHRO magar Orientation (CHRO Magar，法国)则因加入不同底物既可对细菌鉴定也可对酵母样真菌鉴定，但临床评价认为对常见革兰阴性菌如大肠埃希菌、变形杆菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌及阳性菌中的肠球菌鉴定较准确，其他病原菌尚需进一步用其他试验鉴别［7］。Samra等［8］在进一步评价该培养基对尿中常见病原菌鉴定准确性的同时，认为该培养基上生长的菌落对药敏试验没有影响。
除用特异性酶直接鉴定菌种外，也可利用其他特征进行直接菌种鉴定。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的早期检测，是预防和控制该菌感染的有效途径。近年虽然对其准确检测方法进行了广泛研究，但均局限于微生物实验室检测。最近Mir等［9］建立了一种由临床医生或护士操作的直接用临床标本筛选MRSA的培养基(SSMAC)。使用时用棉拭子取标本接种软琼脂中，35℃培养24小时后产生鲜艳黄色为MRSA，桔黄或淡黄为中介，红色为阴性。临床试验表明，此法敏感性和特异分别达到89.4%和100%，使临床医生可随时了解MRSA感染情况。
沙门菌是常见的肠道致病菌，Rambach［10］证实非伤寒沙门菌可特异性分解丙烯乙二醇(propylene glycol, PG)产酸使中性红指示剂变红，因而非伤寒沙门菌菌落呈红色，分解乳糖细菌则因加入5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-呋喃半乳糖苷而显蓝色，分解2种底物的细菌(如费劳地枸橼酸杆菌)为紫色，其他细菌菌落无色。临床评价显示［11］该培养基的敏感性和特异性分别为69%和98%。其不足之处是不能直接鉴定伤寒沙门菌。
最近Siau等［12］报道利用血平板(人血、马血、羊血均可)中加入不同的醛糖(如葡萄糖、半乳糖、木糖等)，可对引起严重医院获得性肺炎的鲍氏不动杆菌等进行直接鉴定。特征是这些菌可使菌落周围的培养基形成独特的棕色，而其他非发酵菌则无此现象。
二、用特异性酶进行快速菌种鉴定
病原菌分离后需进行菌种鉴定。目前所用方法主要是利用不同生化试验进行鉴定，其缺点是需菌株生长，因而延误鉴定时间。利用特异性酶试验对菌种进行鉴定，则无需菌株生长，因而可对包括苛养菌和生长缓慢的细菌等进行快速鉴定，多数鉴定试验仅需数分钟即可获得结果。
单核细胞增多李斯特菌是引起人李斯特菌病的主要病原，因能在4℃生长，也常引起冷藏食品污染。目前对李斯特菌的鉴定主要依赖于溶血、糖发酵试验及CAMP试验，鉴定方法费时且繁琐，有时因表型特征不典型而造成鉴定错误。Clark等［13］用DL-丙氨酸-β-萘胺和D-丙氨酸-对-硝基苯胺对单核细胞增多李斯特菌丙氨酸氨基肽酶进行测定，227株不同李斯特菌中只有单核细胞增多李斯特菌2种酶均为阴性，其他5种菌则2种酶均阳性，鉴定仅需4小时，因此可快速与其他李斯特菌鉴别。
L-吡咯烷酮(L-pyrrolidonyl)肽酶虽然不是沙门菌的特异性酶，但在与弗劳地枸橼酸杆菌鉴定中早有应用，前者此酶为阴性而后者为阳性。Inoue等［14］在纸片法测定此酶的基础上，引入纸片法测定吲哚和脱氨基酶试验，可准确鉴别沙门菌与其他肠杆菌，试验仅需10分钟。沙门菌此3种试验均为阴性，而其他菌或1种或2种试验为阳性。
对难辨梭菌的鉴定主要根据在CCFA选择性培养基上的生长情况，但有与难辨梭菌生长相似的梭菌，因此还需对这些厌氧菌作出准确鉴定。Fedorko等［15］报道，在CCFA培养基础上用L-脯氨酸氨基肽酶(LPA酶)可对难辨梭菌快速确认，仅需2分钟。对50株难辨梭菌检测显示LPA酶全部为阳性，其他梭菌则为阴性。
血清芽管试验可对白念珠菌进行快速鉴定，但因少数菌株芽管试验阴性而影响该试验的准确性。采用特异性酶试验鉴定白念珠菌不仅快速，而且鉴定准确性也有所提高。MUAG candi试剂盒(Biolife，意大利)是将1滴MUAG底物加在菌落上，反应3分钟后观察结果，显蓝色荧光菌落为白念珠菌，鉴定仅需3分钟［2］。文献［16］报道同时检测L-脯氨酸氨基肽酶(L-proline aminopeptidase, PRO)和NAG酶可提高白念珠菌的鉴定准确性。Albistrip试剂条(英国)［17］通过检测此两种酶仅用5分钟即可对白念珠菌作出鉴定，敏感性和特异均为98%。
