人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析
【 摘要 】 目的 获取人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A亚单位(HspA)的DNA(hspA)，并将它克隆到质粒PinPointTMXa-3中进行核苷酸序列分析。 方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA，并将其定向插入PinPointTMXa-3载体中通过4种荧光染料标记，激光检测的方法进行核苷酸序列分析。 结果 DNA序列分析表明，所克隆的HspA DNA序列与GenBank公布的一致。 结论 本研究获得了序列正确的HspA基因，为其重组表达及相关研究奠定了良好基础。 Clone and sequence analyse of human Helicobacter pylori heat shock protein A gene
GUO Xueqing, ZOU Quanming, ZHANG Weijun. Department of Clinical Microbiology,
Third Military Medical University, Chongqing 400038,P.R.China
【 Abstract 】 Objective To obtain DNA of human Helicobacter pylori (Hp) heat schok protein A(HspA), and the amplified fragment was inserted into the plasmid PinPointTMXa-3 for nucleotide sequence analysis. Methods
The HspA DNA was amplified by PCR and inserted into PinPointTMXa-3, and the sequence was analysed with the laser detection of four special marked fluorescent dyes stained products. Result DNA sequence analysis showed the the sequence of HspA DNA was the same as that of the pulished by GenBank. Conclusion A confirmed HspA gene has been obtained, thus a good foundation for recombinantion, expression and associated research laid.
【 Subject words 】 Helicobacter pylori; Heat shock protein A
人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活动性胃炎的病原体，亦是消化性溃疡和胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的重要致病因子。世界卫生组织已把Hp列为与胃癌发生有关的病原体〔1〕，Hp的致病性包括它的动力、粘附力、尿素酶、磷脂酶A、热休克蛋白(Hsp)和毒素。毒素包括空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A, VacA)和细胞毒素相关A蛋白〔2〕(Cytotoxin associated gene A protein, CagA)。新近研究表明：Hp的尿素酶B亚单位(UreB)、热休克蛋白A亚单位(HspA)和VacA均是有效的抗原成份。HspA为所有Hp共同的抗原成分。以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%试验小鼠获得保护〔3〕。由于Hp属微需氧菌，培养条件高，难以获得大量的天然来源的HspA成分。
目前国内尚未见有关Hp HspA的研究报道，我们运用PCR技术克隆人Hp保护性抗原HspA基因，并构建载体对其进行序列分析，现叙述如下。
材料和方法质粒和菌株：质粒PinPointTmXa-3购自Promega公司。E.coli JM109及Hp菌株系本室保存菌种。
培养基：(1) Hp固体培养基为本室自配；(2) LB培养基按参考文献的方法配制〔3〕。
工具酶及试剂：EcoRⅤ、HindⅢ购自宝灵曼公司，T4连接酶、Taq DNA聚合酶和DNA标准分子质量λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ markers, PCR markers 购自华美公司。其它常规试剂按照《分子克隆实验指南》要求配制。
细菌分离纯化鉴定：自临床采尿素酶反应阳性的消化性溃疡病人的胃粘膜标本直接涂布于Hp培养基中，置5%O2，85%N2，10%CO2 37℃的条件下分离培养，培养3d后挑取可疑菌落进行形态及生化鉴定确定，革兰氏染色镜检阴性。S形或弧形，尿素酶、氧化酶、触酶试验阳性，同时做Hp的尿素酶PCR试验阳性的菌株作为Hp阳性菌株，保存于Hp液体培养液及甘油中，-80℃冻存。
细菌基因组DNA的制备：按《精编分子生物学实验指南》的基因组DNA小量制备法制备。
引物的合成：根据文献〔4〕的HspA序列设计一对特异引物，在上游引物加HindⅢ的酶切位点，下游引物加EcoRⅤ的酶切位点。为利于重组表达，在两个5′端分别设置起始密码子ATG和终止密码子TAA。为保持两引物的Tm值相似，将序列的末端几个碱基删除，为使所扩增基因的AAGCTT片段不被HindⅢ酶解，把后一个“T”突变为“G”。
P1: 5′-CCC AAG CTT ATG AAG TTT CAA CC-3′
P2: 5′-GAC GAT ATC TAA ATG ACA GCG AGC TTC-3′
引物由北京赛百盛公司合成，C-18纯化。
PCR反应体系：10×PCR扩增缓冲液10μl，4种dNTP混合液（各10mmol/L）2μl，上、下游引物（各20pmol/L）2μl，模板DNA 5μl，加水至终体积100μl。
目的基因的分离：反应混合物于94℃加热，变性5min加入1μl Taq DNA聚合酶（3U/μl）接着进入循环，94℃变性1min, 55℃ 1min，72℃ 1min共循环35次，再于72℃延伸5min，反应完毕后取4μl反应产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，确定后，经酚、酚/氯仿、氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解，紫外定量，-20℃保存备用。
重组测序及表达载体的构建：载体PinPointTmXa-3和PCR产物均用EcoRⅤ，HindⅢ酶切，然后用低熔点琼脂糖凝胶法纯化回收DNA片段，将回收后的PinPointTmXa-3/EcoRⅤ+HindⅢ和PCR产物/EcoRⅤ+HindⅢ在14℃连接14～16h。PCR产物与PinPointTmXa-3 摩尔比为3∶1。
